Testes Confirmatórios para Diagnóstico de HIV-1 e HIV-2: Imunofluorescência e Western Blot, Notas de estudo de Biomedicina

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USAS Testes confirmatórios $ SAS inistério da Saúde narama Nacional de NST/nInS Ministério da Saúde Carlos César Silva Albuquerque Ministro de Estado da Saúde Antonio Joaquim Werneck Secretário de Assistência à Saúde Pedro José Novais Chequer Coordenador Geral do Programa Nacional de DST/AIDS-MS Miriam Franchini Coordenadora Geral do projeto TELELAB Autores: Antônio Gomes Pinto Ferreira Cláudia Renata Fernandes Martins José Antônio Pinto de Sá Ferreira Luiz Alberto Peregrino Ferreira Luiz Fernando de Goes Siqueira Maria Luíza Bazzo Miriam Franchini Oscar Jorge Berro Silvio Valle Assessoria Pedagógica: Maria Lúcia Ricciotti Ribinik Maristela Arantes Marteleto Diagnóstico sorológico do HIV - Testes confirmatórios. – Brasília: Ministério da Saúde, Programa Nacional de Doenças Sexualmente Transmissíveis e AIDS. 1997. 67p, il. (Série TELELAB) 1. HIV I. Programa Nacional de Doenças Sexualmente Transmissíveis e AIDS (Brasil). II. Serie TELELAB. APRESENTAÇÃO____________________________________________04 INTRODUÇÃO ______________________________________________09 fluxograma ________________________________________________ 10 IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA PARA HIV-1 ________________13 material necessário para a reação de IFI ____________________ 14 estoque e conservação dos materiais _______________________ 16 titulação do conjugado ____________________________________ 17 realização da reação de IFI para para HIV-1_________________ 23 leitura e interpretação de IFI para HIV-1 _____________________ 26 WESTERN BLOT PARA HIV-1 __________________________________29 seqüência da reação de WB para HIV-1_____________________ 29 material necessário para a reação de WB ___________________ 31 realização da reação de WB para HIV-1_____________________ 32 leitura e interpretação da reação de WB para HIV-1 _________ 34 amostras para investigação de HIV-2________________________ 36 CONTROLE DE QUALIDADE__________________________________39 importância do protocolo e controle de qualidade internos __ 39 obtenção dos soros-controle e programa de avaliação externa da qualidade ______________________________________ 40 FÓRMULAS _________________________________________________43 ANEXOS ___________________________________________________47 BIOSSEGURANÇA____________________________________ I - XIV CONSIDERAÇÕES FINAIS _____________________________ a – g REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde Diagnóstico sorológico do HIV – Testes confirmatórios Agora você faz parte do sistema de educação a distância para profissionais da saúde, envolvidos com o diagnóstico laboratorial das Doenças Sexualmente Transmissíveis - DST/AIDS - TELELAB. O TELELAB foi criado para levar até você cursos com informações indispensáveis para que seu trabalho seja realizado dentro dos padrões de qualidade estabelecidos pelo Programa Nacional de Doenças Sexualmente Transmissíveis/AIDS do Ministério da Saúde PN-DST/AIDS - MS. Assistindo ao programa de vídeo e estudando este manual, você terá a oportunidade de verificar o que pode ser mudado no seu dia-a- dia e o que pode ser mantido. Assim, você terá mais confiança nos resultados do seu trabalho e mais tranqüilidade no que se refere à sua segurança pessoal. GUARDE ESTE MANUAL PARA CONSULTAR SEMPRE QUE NECESSÁRIO. ELE É SEU. USE-O! Diagnóstico sorológico do HIV – Testes confirmatórios PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde Para esclarecimento de dúvidas e sempre que precisar, comunique-se diretamente com: TELELAB - PN-DST/AIDS – MS Telefax gratuito: 0800 - 61 – 2436 Funcionamento do seu curso TELELAB Inscrição Pré-teste Agora que você já fez a inscrição e o pré-teste, está na hora de se organizar para fazer seu curso! Você tem um mês para concluí-lo. Vídeo e Manual Assista ao vídeo quantas vezes você precisar. No manual, estão todos os conteúdos para o seu estudo. Pós-teste e Questionário de Avaliação Faça o pós-teste e responda ao questionário de avaliação. Suas informações são fundamentais para a melhoria do TELELAB. Certificado Para obter o certificado, você deverá acertar no mínimo 80% do teste. Depois da correção do seu teste pelo PN-DST/AIDS, você receberá o certificado Ao final deste curso você será capaz de: identificar os fundamentos dos testes e os procedimentos para execução recomendados pelo PN-DST/AIDS-MS para o diagnóstico sorológico do HIV-1 na fase confirmatória; e executar o diagnóstico sorológico do HIV-1, obedecendo aos critérios técnicos, critérios de controle de qualidade e cuidados de biossegurança recomendados. PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde Diagnóstico sorológico do HIV – Testes confirmatórios Introdução Você já viu, no curso TELELAB, diagnóstico sorológico do HIV - Testes de Triagem, que, em algumas situações, é necessário realizar testes confirmatórios. O uso de testes confirmatórios tem como principal objetivo assegurar que uma amostra reagente na triagem seja verdadeiramente positiva. O Ministério da Saúde, por meio do PN-DST/AIDS, recomenda, como testes confirmatórios, a imunofluorescência indireta - IFI e o Western Blot – WB. Esses testes possuem sensibilidade e especificidade adequadas para caracterizar as amostras inicialmente reagentes. Para a definição dos resultados, as amostras com resultados reagentes nos dois testes de triagem, ou com resultados contraditórios, ou indeterminados, devem ser submetidas a IFI. Nos casos em que a IFI não caracterizar a amostra, você deverá utilizar o WB. Confira no fluxograma os procedimentos para caracterizar as amostras através dos testes confirmatórios. 9 PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde Diagnóstico sorológico do HIV – Testes confirmatórios FLUXOGRAMA PARA O DIAGNÓSTICO SOROLÓGICO DO HIV 10 Diagnóstico sorológico do HIV – Testes confirmatórios PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde O que é uma reação de IFI para HIV-1? A IFI é uma reação que utiliza, como fase sólida, lâminas de vidro com 12 demarcações. Cada demarcação contém, como antígeno, células da linhagem K37-3, de origem linfocitária, infectadas pelo HIV-1 (Etapa 1). Todas as células estão infectadas, mas aproximadamente 25 a 35% das células possuem antígenos virais capazes de serem detectados em sua superfície. A reação entre o antígeno fixado e o anticorpo presente nas amostras (Etapa 2) é evidenciada após a adição de anti-imunoglobulina humana (IgG) conjugada ao isotiocianato de fluoresceína (Etapa 3). Para a leitura da reação, é necessário utilizar microscópio de fluorescência. Figura 1: seqüência de uma reação de imunofluorescência indireta para HIV-1 13 PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde Diagnóstico sorológico do HIV – Testes confirmatórios Qual o material necessário para executar uma reação de IFI para HIV-1? O Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos Bio-Manguinhos/FIOCRUZ/ MS fornece os seguintes materiais: lâminas de imunofluorescência, contendo células da linhagem K37-3 infectadas experimentalmente pelo HIV-1; anti-imunoglobulina humana (IgG) conjugada ao isotiocianato de fluoresceina; glicerina tamponada pH 9,0 ± 0,5; azul de Evans a 0,1%; soro-controle positivo com titulo conhecido; e soro-controle negativo. Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos Bio-Manguinhos/FIOCRUZ/MS Endereço: Av. Brasil, 4365 - Rio de Janeiro/RJ CEP: 21.045-900 Telefones: (021) 598.4284 / (021) 260.2344 Fax: (021) 260.4727 14 Diagnóstico sorológico do HIV – Testes confirmatórios PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde Outros materiais necessários não fornecidos: pipetas automáticas com volumes variáveis de 5 a 50 l, 50 a 200 I e de 200 a 1.000 I; ponteiras para pipetas automáticas; tubos de ensaio para diluição de amostras e controles; estante para tubos de ensaio; câmara úmida; cubas para lavagem de lâminas (tipo Koplin); lamínulas 24 x 50 mm; microscópio para fluorescência; provetas de 1.000 ml; béquer de 2.000 ml; balança semi-analítica e acessórios para pesagem; agitador magnético; agitador rotatório tipo Kline; barra magnética; luvas de látex descartáveis; água destilada; tampão fosfato PBS pH 7,2 (vide Fórmulas); recipiente de paredes rígidas, boca larga e tampa, contendo hipoclorito de sódio a 2%; estufa a 37°C; e protocolo (vide Anexos). 15 PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde Diagnóstico sorológico do HIV – Testes confirmatórios 5. prepare um protocolo de trabalho, indicando a posição do Controle Positivo (CP) e do Controle Negativo (CN), conforme mostrado a seguir: 6. dilua o soro-controle negativo (CN) a 1/8. Para realizar esta diluição, coloque em um tubo 20 µl de soro e adicione 140 µl de PBS pH 7,2. Homogeneíze suavemente, evitando a formação de bolhas; 7. dilua o soro-controle positivo (CP) até o título descrito no rótulo do frasco. Utilize o esquema de diluições seriadas que segue: Atenção Homogeneíze o conteúdo de cada tubo antes de transferir 160µI para o tubo seguinte. 18 Diagnóstico sorológico do HIV – Testes confirmatórios PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde 8. pipete, de acordo com seu protocolo, 10 µl do controle negativo diluído a 1/8, nas demarcações correspondentes da lâmina; 9. seguindo seu protocolo de trabalho, pipete, nas demarcações da lâmina, 10 µl da diluição correspondente ao título do controle positivo, descrito pelo fabricante; 10. coloque a lâmina em câmara úmida e incube em estufa a 37°C, durante 30 minutos; 11. mergulhe rapidamente a lâmina em um recipiente contendo PBS pH 7,2, para retirar o excesso de reagentes; 12. coloque a lâmina na cuba tipo Koplin e adicione PBS pH 7,2, até cobri-la completamente; 13. coloque a cuba em agitação durante 5 minutos. Caso você não tenha um agitador do tipo Kline, faça sucessivas e cuidadosas agitações manuais pelo mesmo período; 14. repita os passos 12 e 13 mais duos vezes, trocando o PBS em cada uma delas; 15. lave rapidamente a lâmina em água destilada; Atenção Não deixe que a ponteira da pipeta toque ou raspe a superfície da lâmina, para não remover as células. Tome cuidado para que o conteúdo das diferentes demarcações não se misture. Utilize ponteiras diferentes para os controles positivo e negativo. 19 PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde Diagnóstico sorológico do HIV – Testes confirmatórios 16. coloque a lâmina em estufa a 37°C, para a completa secagem, por aproxidamente 10 minutos; 17. prepare uma solução PBS - azul de Evans (PBS-AE) a 0,004%, colocando em um tubo 40 µl da solução azul de Evans a 0,1 % e adicionando 960 µl de PBS pH 7, 2. Homogeneíze suavemente, evitando a formação de bolhas; 18. diluição do conjugado: dilua o conjugado a 1/50, colocando em um tubo, previamente identificado 10 µl do conjugado e 490µ de PBS -AE: Atenção Prepare a solução PBS-AE a 0,004% imediatamente antes da diluição do conjugado. 20 Diagnóstico sorológico do HIV – Testes confirmatórios PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde Como realizar a reação de IFI para HIV-1? 1. Leia atentamente todas as instruções do fabricante antes de iniciar a reação; 2. retire os soros-controle do congelador e deixe-os atingir a temperatura ambiente. Pegue as amostras a serem testadas e deixe- as, também, atingirem a temperatura ambiente; 3. retire da geladeira a anti-imunoglobulina humana conjugada ao isotiocianato de fluoresceína, a glicerina tamponada e o azul de Evans e deixe-os atingir a temperatura ambiente; 4. faça o protocolo de trabalho (vide Anexos). Lembre-se de que os soros-controle positivo e negativo devem estar presentes em todas as lâminas para comparação no momento da leitura; 5. retire do congelador o número necessário de lâminas e deixe-as descongelar até atingirem a temperatura ambiente. Depois coloque- as em estufa a 37°C, até sua completa secagem; 6. dilua as amostras a serem testadas e os soros-controle, positivo e negativo, a 1/8 em PBS. Para realizar esta diluição, coloque em um tubo 10 µl de soro-controle ou de cada amostra e adicione 70 µl de PBS pH7,2. Homogeneíze suavemente, evitando a formação de bolhas; 7. pipete, em cada demarcação da lâmina, 10 µl das diluições dos soros-controle (CP e CN) e das amostras, de acordo com seu protocolo de trabalho; Atenção Não deixe que a ponteira da pipeta toque ou raspe a superfície da lâmina, para não remover as células. Tome cuidado para que o conteúdo das diferentes demarcações não se misture. Utilize uma ponteira para cada soro-controle e para cada amostra aplicada. 23 PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde Diagnóstico sorológico do HIV – Testes confirmatórios 8. coloque a(s) lâmina(s) em camara úmida e incube, em estufa a 37°C, durante 30 minutos; 9. mergulhe rapidamente a(s) lâmina(s) em um recipiente contendo PBS pH 7,2, para retirar o excesso de reagentes; 10. coloque a(s) lâmina(s) na cuba tipo Koplin e adicione PBS pH 7,2, até cobri-la(s) completamente; 11. coloque a cuba em agitação durante 5 minutos. Caso você não tenha um agitador do tipo Kline, faça sucessivas e cuidadosas agitações manuais pelo mesmo período; 12. repita os passos 10 e 11 mais duas vezes, trocando o PBS em cada uma delas; 13. lave rap8idamente a(s) lâmina(s) em água destilada; 14. coloque a(s) lâmina(s) em estufa a 37°C, para a completa secagem, por aproxidamente 10 minutos; 15. prepare uma solução PBS - Azul de Evans (PBS-AE) a 0,004%. Para isso, dilua 25 vezes a solução Azul de Evans a 0,1 % em PBS pH7,2. Prepare somente o volume necessário para diluir o conjugado Veja, no quadro a seguir, exemplos de volumes que podem ser preparados, em função do número de lâminas utilizadas; Volume Número de lâminas PBS pH 7,2 Azul de Evans 0,1% 1 a 2 480 µl 20 µl 3 a 4 960 µl 40 µl 5 a 6 1440 µl 60 µl 24 Diagnóstico sorológico do HIV – Testes confirmatórios PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde 16. dilua o conjugado (anti-imunoglobulina humana-isotiocianato de fluoresceína), previamente titulado, na soluço PBS-AE a 0,004%; 17. pipete 15µI do conjugado diluído em cada demarcação da(s) lâmina(s); 18. incube, lave e seque a(s) lâmina(s), segundo os procedimentos descritos anteriormente nos itens 8 a 14; 19. prepare a(s) lâmina(s) para leitura, aplicando duas a três gotas de glicerina tamponada pH 9,0±0,5 sobre elas. Cubra cada lâmina com uma lamínula 24 x 50 mm, evitando a formação de bolhas. Mantenha a(s) lâmina(s) ao abrigo da luz e em local seco até a leitura; 20. faça a leitura da reação em microscópio de fluorescência, utilizando objetiva de 40 X. Anote, em seu protocolo, os resultados observados. Atenção O conjugado deve ser previamente titulado, para se determinar a diluição correta a ser utilizada. 25 PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde Diagnóstico sorológico do HIV – Testes confirmatórios O que é uma reação de "Western Blot" - WB para HIV-1? O WB é uma reação que utiliza membrana de nitrocelulose como fase sólida. As proteínas e glicoproteínas virais que atuam como antígeno são separadas eletroforeticamente, em gel de poliacrilamida, segundo seus pesos moleculares e transferidas ("blotted") para a membrana (Etapa 1). A reação entre o antígeno adsorvido à membrana e os anticorpos da amostra (Etapa 2) é revelada por um processo enzimático. Adiciona-se o conjugado 1, composto por uma anti-imunoglobulina humana conjugado com biotina (Etapa 3). e o conjugado 2, que é composto de avidina ligada a uma enzima (Etapa 4). A degradação do substrato origina um produto insolúvel e corado (Etapa 5) que permite, a olho nu, a visualização da reação sobre a fita. Alguns conjuntos de WB para HIV-1 utilizam outros sistemas no lugar da avidina e da biotina, para revelação da reação. 29 PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde Diagnóstico sorológico do HIV – Testes confirmatórios Figura 1: seqüência esquemática de uma reação de WB para HIV-1 30 Diagnóstico sorológico do HIV – Testes confirmatórios PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde 4. faça um protocolo de trabalho (vide Anexos), relacionando os controles e o registro das amostras com o número existente em cada tira de nitrocelulose; 5. deixe as amostras e os reagentes atingirem a temperatura ambiente antes de iniciar a reação; 6. utilize pinças plásticas para manipular as tiras de nitrocelulose a serem utilizadas na reação; 7. coloque cada uma das tiras dentro de uma canaleta, mantendo a face numerada voltada para cima; 8. tampe as placas plásticas para evitar a mistura dos conteúdos de diferentes canaletas; 9. observe rigorosamente todos os volumes, os tempos e as formas de agitação e incubação recomendados pelo fabricante; 10. descarte em solução de hipoclorito de sódio a 2%, todos os produtos e insumos, incluindo os utilizados nos processos de lavagem. Atenção Siga passo a passo todas as instruções do fabricante, pois qualquer alteração ou variação na execução do WB para HIV-1 poderá produzir resultados errôneos ou duvidosos. 33 PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde Diagnóstico sorológico do HIV – Testes confirmatórios Além disso, para garantir a qualidade dos resultados é importante que você: não use reagentes com prazo de validade vencido. Verifique se os reagentes encontram-se dentro dos especificações, sem turvação, precipitados ou com coloração alterada; não misture controles, conjugados, tampões, reagentes e tiras de diferentes lotes e/ou fabricantes; armazene os conjuntos para diagnóstico de acordo com as recomendações do fabricante; não exponha o substrato à luz durante a estocagem ou incubação, pois poderá ocorrer a fotodecomposição do mesmo; não coloque o substrato em contato com substâncias oxidantes ou metais, para evitar a precipitação, que torna o produto impróprio para o uso; faça a limpeza e a manutenção periódica dos equipamentos utilizados na reação. Como fazer a leitura e interpretação dos resultados de um teste de WB para HIV-1? A leitura é realizada por observação visual, sem a necessidade de uso de qualquer tipo de aparelho. Para interpretação dos resultados, o PN-DST/AIDS-MS recomenda os critérios estabelecidos pelo Centro de Controle de Doenças e Prevenção (CDC), de Atlanta, nos Estados Unidos, apresentados no quadro a seguir: 34 Diagnóstico sorológico do HIV – Testes confirmatórios PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde Critérios para interpretação dos resultados de WB para HIV-1 Amostra negativa: ausência total de bandas. Amostra positiva: presença de pelo menos duas das bandas gp 160/120, gp41 e p24, acompanhadas ou não de outras bandas. Amostra indeterminada: qualquer outro padrão diferente dos descritos anteriormente. Figura 2: representação esquemática da posição das proteínas e glicoproteínas do HIV-1 em uma tira de nitrocelulose. 35 PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde Diagnóstico sorológico do HIV – Testes confirmatórios Qual a importância de um protocolo de trabalho no realização de um teste? O protocolo é um documento laboratorial de registro das amostras com valor legal. Ele estabelece a ordem das amostras a serem testadas, de forma que qualquer pessoa possa interpretar os resultados. Alguns métodos utilizam equipamentos para imprimir os resultados e o material impresso deve ser guardado junto com o protocolo. Veja, no título Anexos deste manual, exemplos de protocolo para IFI e WB. Que outras medidas podem ser adotadas para assegurar resultados confiáveis? Para assegurar que os resultados finais sejam confiáveis é fundamental: utilizar soros para controle de qualidade interno; participar de um programa que forneça os soros-controle; participar de um programa de avaliação externa da qualidade. O que é controle de qualidade interno? Controle de qualidade interno de um ensaio corresponde ao uso de amostras positivas e negativas, obrigatoriamente incluídas em cada ensaio. Essas amostras são fornecidas pelos fabricantes e podem, também, ser preparadas em seu Iaboratório. O preparo ou uso de soros-controle próprios constitui um excelente mecanismo de análise de possíveis variações lote a lote. Os controles também podem ser utilizados para avaliação da reprodutibilidade dos testes, em um mesmo ensaio (intra-ensaio) ou ensaios diferentes (inter-ensaio), de um mesmo lote. 39 PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde Diagnóstico sorológico do HIV – Testes confirmatórios Como obter soros-controle? Podem ser adquiridos de diversas instituições que possuem soros controles para a venda. O PN-DST/AIDS-MS desenvolveu um projeto de distribuição de soro-controle. Informações podem ser obtidas pelo telefax gratuito 0800-612436, do TELELAB. O que é um programa de avaliação externa de qualidade? Um programa de avaliação externa da qualidade envolve um mecanismo de análise, no qual o laboratório recebe um painel de amostras que são incluídas na sua rotina. Os resultados obtidos são enviados a um Centro de Referência e analisados, possibilitando a avaliação confidencial do desempenho de cada laboratório. Porque adotar medidas de controle e participar de avaliação externa da qualidade? A adoção das medidas de controle descritas e a participação em um programa de avaliação externa da qualidade permitem ao laboratório garantir a qualidade dos procedimentos utilizados e conseqüentemente a confiabilidade dos resultados. 40 Diagnóstico sorológico do HIV – Testes confirmatórios PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde Fórmula para preparo de Tampão de Fosfato (PBS) pH 7,2 Sais Quantidade Cloreto de sódio (NaCI) PA (0,15M) 8,77 g Fosfato de sódio dibásico anidro (Na2HPO4) PA (0,01M) 1,02 g Fosfato ácido de sódio anidro (Na H2P O4) PA (0,01M) 0,34 g Água destilada – quantidade suficiente para (qsp) 1.000 ml OBS: Após a completa dissolução dos sais, verifique se o pH encontra-se na faixa indicada pH 7,2±0,2 solução final. Caso contrário, prepare nova solução. Atenção Os sais descritos acima quando não utilizados na forma anidra deverão ter suas quantidades recalculadas em função das moléculas de água presentes. Verifique sempre no rótulo dos produtos a composição e o peso molecular dos sais. 43 PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde Diagnóstico sorológico do HIV – Testes confirmatórios Exemplo de correção de peso para sais na forma hidratada Fosfato de sódio dibásico anidro (Na2 HPO4) PA (0,01M) Peso molecular: 142___________________________________ pesar 1,02g Fosfato de sódio dibásico hidratado (Na2HPO4. 12 H2O) PA (0,01M) Peso molecular: 359___________________________________ pesar X g Cálculo Neste exemplo, onde o Fosfato de sódio dibásico hidratado contém 12 moléculas de água, deve-se pesar 2,57g para preparar o PBS pH7,2. Para correção do peso de qualquer sal hidratado, utilize uma regra de três simples, relacionando o peso molecular e a quantidade a ser pesada, como demonstrado. Atenção Antes de pesar qualquer sal, verifique sempre na embalagem sua composição e seu peso molecular. 142 X = 1,02 X 359 X = 1,02 x 359 142 X = 2,57g 44 Diagnóstico sorológico do HIV – Testes confirmatórios PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde Teste de Western Blot para HIV-1 Protocolo Fabricante____________________ Lote: ____________ Validade:___________ Data de realização _____/ _____/ _____ Técnico responsável: _____________ Observações: ______________________________________________________________ 48 Diagnóstico sorológico do HIV – Testes confirmatórios PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde VoNvandassola  Use sempre Equipamento de Proteção Individual (EPI): avental ou jaleco longo de mangas compridas e punho retrátil, luvas descartáveis, óculos de proteção, pipetadores manuais ou automáticos e, quando for o caso, protetor facial. Os EPI são regulamentados pelo Ministério do Trabalho e seu uso visa a minimizar a exposição do técnico aos riscos e evitar possíveis acidentes nos laboratórios. Note que, às vezes, os profissionais de laboratório precisam de um tempo para se adaptar ao uso dos equipamentos na sua rotina. O importante é que você se adapte e incorpore a utilização dos EPI à sua prática profissional. O uso indevido dos EPI, ao invés de proteger, poderá ocasionar acidentes. Figura 2. Ilustração dos principais equipamentos de proteção individual (EPI) III PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde Biossegurança Evite a formação e dispersão de aerossóis. Aerossóis são micropartículas sólidas e líquidas com dimensões aproximadas entre 0,1 e 50 micro que podem, caso contenham microorganismos, permanecer em suspensão e plenamente viáveis por várias horas. A pipetagem, flambagem de alças, abertura de frascos e ampolas, manipulação de seringas, agulhas, lancetas, lâminas e outros assemelhados podem gerar e propagar aerossóis. Abertura de frascos, ampolas, tubos e garrafas de cultura requer cuidados especiais. Envolva a parte a ser aberta com um pedaço de gaze. Utilize um pedaço de gaze para cada material, prevenindo assim a contaminação cruzada. Descarte-a imediatamente em hipoclorito de sódio a 2%. Centrífugas, agitadores e maceradores, quando manipulados sem as precauções e abertos antes da total parada ou término da operação, igualmente podem contaminar o ambiente laboratorial. IV Biossegurança PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde Jamais reencape agulhas. Esse procedimento é uma das principais causas da contaminação de profissionais de saúde por microorganismos, existentes no sangue e em outros fluidos orgânicos, como por exemplo, o vírus da hepatite B e o HIV. Após a coleta, você deve descartar esse material diretamente em recipiente de paredes rígidas com tampa, contendo hipoclorito de sódio a 2% em volume superior a metade do recipiente. Lembre-se: cada mililitro de sangue contaminado com o vírus da hepatite B contém 100.000.000 de partículas virais, que podem permanecer viáveis por até uma semana. Basta 1(uma) dessas partículas para contaminar uma pessoa. Figura 3. Ilustração do descarte de agulha em recipiente apropriado. V PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde Biossegurança Figura 5. Principais símbolos internacionais associados aos riscos em Iaboratórios. VIII Biossegurança PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde Verifique sempre as condições de funcionamento dos Equipamentos de Proteção Coletiva (EPC): extintores de incêndio, chuveiros de segurança, lava-olhos, pia para lavagem de mãos, caixa de areia e cabine de segurança biológica. Existem três tipos de cabines de segurança biológica disponíveis no mercado: as de classe I, classe II e classe III. São recomendadas para o uso em Iaboratórios clínicos as de classe II. Veja a figura 6, na página seguinte. Procedimentos que devem ser observados na cabine de segurança biológica: descontamine a superfície interior, antes e depois do uso, com gaze estéril embebida em desinfetante adequado; ligue a cabine e a luz ultravioleta 20 minutos antes e deixe tudo ligado pelo mesmo tempo ao final de sua utilização; use avental de mangas longas, luvas descartáveis e máscara; não efetue movimentos rápidos ou bruscos dentro da cabine e evite operações que causem turbulência; não use bico de Bunsen, pois pode acarretar danos ao filtro HEPA e causar desequilíbrio do fluxo de ar. Se necessário, use incinerador elétrico ou microqueimador automático; e mantenha as grelhas anteriores e posteriores da cabine desobstruídas. A cabine não e um depósito. Evite guardar equipamentos ou quaisquer outros objetos no seu interior. IX PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde Biossegurança Figura 6 : ilustração das cabines de segurança biológica - classes I, II e III. As cabines de classe I e II são consideradas como barreira de proteção parcial e a de classe III é uma barreira de proteção total. X Biossegurança PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde Tenha muito cuidado com a manipulação e estocagem de substâncias químicas. Leia com atenção as informações contidas nos rótulos A estocagem de matéria-prima deve ser feita em armários apropriados, bem ventilados, ao abrigo da luz solar e calor. É importante observar a incompatibilidade entre as diferentes substâncias. Sempre que recomendado pelo fabricante, os agentes químicos devem ser manipulados em capelas de exaustão química devidamente instaladas. Atenção: não confunda capela de exaustão química com cabine de segurança biológica. Veja a seguir os riscos relacionados a cada categoria química: Categoria química e riscos relacionados Grupo Químico Risco Ácidos Corrosão Cianetos e Sulfetos Envenenamento Líquidos Inflamáveis Incêndio Sólido Inflamável Incêndio XIII PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde Biossegurança Bases Corrosão Seja sempre consciente da importância de suas ações na preservação da biossegurança em seu local de trabalho: lave as mãos antes e depois de qualquer procedimento laboratorial; nunca pipete com a boca; jamais cheire placas de cultura; dentro do laboratório, não fume, não coma, não beba, não prepare refeições; quando estiver usando luvas, não manuseie objetos de uso comum, como telefones, maçanetas de portas e janelas, jornais, revistas, etc.; não guarde alimentos ou bebidas em geladeiras e congeladores para armazenagem de material biológico; e vacine-se rotineiramente contra a hepatite B. Seguindo essas recomendações, você vai estar contribuindo para a diminuição de acidentes Se acontecer um acidente de trabalho em seu laboratório, notifique imediatamente a sua chefia. XIV Biossegurança PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde Muitas das atividades aqui descritas já fazem parte do seu cotidiano. Faça uma reflexão sobre o que acabou de ler e verifique o que pode ser mantido, modificado e incorporado a seu trabalho e ao seu laboratório para que a sua prática profissional se desenvolva de acordo com os procedimentos técnicos e cuidados de biossegurança recomendados pelo Programa Nacional de Doenças Sexualmente Transmissíveis e AIDS, do Ministério da Saúde. As questões colocadas a seguir facilitarão essa reflexão. Considerações finais a PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde Biossegurança Segurança geral O laboratório é devidamente fechado e seguro quando não está ocupado? As portas e janelas são mantidas devidamente fechadas? Os materiais tóxicos e equipamentos de risco são estocados em área segura? Prevenção de incêndio Existe sistema de alarme? As passagens pelas portas de emergência estão desobstruídas? O sistema de detecção de incêndio está em bom funcionamento e é regularmente testado? Existe sinalização de emergência? Existem extintores de incêndio para os diversos tipos de materiais e em quantidade suficiente? Os extintores estão dentro do prazo de validade? Existe sinal de "não fumar" na área de laboratório? A equipe está treinada em combate a incêndio? Estocagem de líquidos inflamáveis O local está separado do prédio principal? Existe ventilação suficiente para retirar vapores? O local está devidamente sinalizado? Existem lâmpadas seladas para proteção contra ignição nos vapores? Existe advertência de "não fumar"? d Biossegurança PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde Risco com eletricidade As instalações estão de acordo com os padrões estabelecidos pela ABNT? Existe fio de terra? Os equipamentos estão devidamente aterrados? Os equipamentos com potencial de risco de desligamento estão devidamente ligados a um circuito de emergência para os casos de queda ou interrupção de energia? Os cabos de conexão aos diversos equipamentos estão em perfeito estado de manutenção? Cada equipamento está ligado em uma tomada; evita-se o uso de benjamim? Todas as tomadas têm sua voltagem identificada? Você sabe onde fica o quadro-geral de força da sua unidade? Gases e líquidos comprimidos Os diversos tipos de gases estão devidamente identificados? Os cilindros possuem válvulas de segurança? Existe advertência de não-utilização de óleo nas válvulas? Os cilindros estão devidamente seguros contra quedas? Existe ventilação suficiente para evitar a formação de bolsões de gases e explosões? Proteção pessoal Existem em quantidade suficiente:l Lava-olhos? Chuveiros de emergência? Proteções contra radiações, incluindo os dozímetros? Máscara contra partículas? Luvas descartáveis? Pipetadores manuais e/ou automáticos? Óculos de proteção e outros? e PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde Biossegurança Segurança e saúde ocupacional Existe serviço de saúde ocupacional? Existe caixa com materiais para primeiros socorros? Existem profissionais treinados em primeiros socorros? Existem informações sobre como agir em caso de emergência, tais como: telefone de hospitais, pronto-socorros e bombeiros? Existe um programa de vacinação atualizado? Existe sinalização educativa para prevenir o risco? Equipamento de laboratório Os equipamentos estão validados e certificados quanto a seu uso? Existe procedimento de desinfecção de equipamentos antes de enviar-los à manutenção? As cabines de segurança biológica e química são regularmente testadas? As autoclaves estão validadas? As centrífugas, rotores e frascos têm seus tempos de utilização devidamente anotados? Vidrarias quebradas e trincadas são descartadas? Existem recipientes adequados para descartar frascos quebrados e material perfurocortante? As capelas de exaustão para manipulação estão devidamente sinalizadas? Suas balanças estão certificadas pelo INMETRO? Seus congeladores, geladeiras, fornos, estufas ou equipamentos termo-reguláveis possuem sinais de controle e registro de temperatura? f Biossegurança PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ATALLAH, A.N. Avaliação crítica dos testes diagnósticos e suas aplicações. Rev. Bras. Pat. Clin. 25(2): 60-63, 1989. CONSTANTINE, N.T. Serologic tests for the retroviruses: approachinn a decade of evolution. AIDS. 7(1): 1-13, 1993. GUIMARÃES, M.C.S. Exames de laboratório: sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo. Rev. Soc. Bras. Med. Trop. 18 (2): 117-120, 1985 MURPHY, F.A; FAUQUET, C.M; BISHOP, D.H.L.; GHRORIAL, D.H.L; JARVIS, A.W.; MARTELLI, G.P.; MAYO, M.A. & SUMMERS, M.D. Virus taxonomy: sixty report of the international committe on taxonomy of viruses. 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Laboratory Safety: Principles and Practices, 2nd. ed. American Society for Microbiology. Washington, DC, 406p. Diagnóstico sorológico do HIV – Testes confirmatórios PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde Agradecimentos: Às equipes do: Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde – INCQS-FIOCRUZ; Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos de BIO-Manguinhos- FIOCRUZ; Laboratório Central de Saúde Pública Noel Nutels do Rio de Janeiro. LACNN – SES; e à Drª. Marisa Morgado Vídeo, projeto gráfico, arte final e impressão: