Toxicidade e biodegradabilidade de contaminantes, Notas de estudo de Química

Baixe Toxicidade e biodegradabilidade de contaminantes e outras Notas de estudo em PDF para Química, somente na Docsity! DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA TEXTIL Y PAPELERA UNIVERSIDAD POLITÉCNICA DE VALENCIA EVOLUCIÓN DE LA TOXICIDAD Y LA BIODEGRADABILIDAD DE CONTAMINANTES PERSISTENTES EN MEDIOS ACUOSOS DURANTE UN PROCESO DE FOTOCATÁLISIS SOLAR EMPLEANDO DIFERENTES TÉCNICAS ANALÍTICAS TESIS DOCTORAL Autor: Rafael Vicente Candela Directores de Tesis: Dra. Dª Ana María Amat Payá (U.P.V.) Dr. D. Antonio Arques Sanz (U. P.V.) Abril 2007 5.10.- APLICACIÓN DE LA METODOLOGÍA EXPERIMENTAL A UNA MUESTRA COMPLEJA 158 6.- CONCLUSIONES 165 7.- APORTACIONES DE LA TESIS 171 7.1.- PARTICIPACIÓN EN CONGRESOS NACIONALES E INTERNACIONALES 173 7.2.- PUBLICACIONES EN REVISTAS CIENTÍFICAS 176 8.- BIBLIOGRAFÍA 179 9. APÉNDICES 211 9.1.- ÍNDICE DE TABLAS 213 9.2.- ÍNDICE DE GRÁFICOS 215 9.3.- ÍNDICE DE FIGURAS 217 9.4.- ÍNDICE DE ECUACIONES 219 AGRADECIMIENTOS A mis directores, Dr. Dª. Ana Mª Amat Paya y Dr. D. Antonio Arques Sanz, por la gran ayuda prestada, el empeño empleado y el tiempo dedicado en la realización de la Tesis; a Alicia Doménech, Rosa Vercher, Lucas Santos-Juanes y Ana García por su apoyo y por su colaboración desinteresada; a Inmaculada de Mora por su gran eficacia en la solución de todos los problemas burocráticos. Al Departamento de Ingeniería Textil y Papelera, cuyo programa de doctorado he realizado y que me ha permitido desarrollar el trabajo experimental en sus instalaciones. A la Universidad Politécnica de Valencia, a la Generalitat Valenciana, al Ministerio de Educación y Ciencia y a la Comunidad Europea por permitirme participar en los proyectos de investigación A los amigos de la Plataforma Solar de Almería y de la Universidad de Almería por sus aportaciones y colaboración. A mis amigos y compañeros de la Escuela Politécnica Superior de Alcoy por su comprensión. A mis hijos Lara y Rafael, y a Margarita. Sin ellos no habría conseguido este objetivo. Gracias por todo su cariño, apoyo y comprensión en todos los momentos, sin los cuales no podría haber realizado este trabajo. ABSTRACT Activated sludge-based biological methods are widely used in wastewater treatment because of their high efficiency and low costs that involve. Nevertheless, some effluents contain toxic or non-biodegradable pollutants that have a negative effect towards the sludge respiration. Advanced oxidation processes or technologies that use sunlight as energy source have proven to be efficient to remove such pollutants and thus, they could be employed as a pre-treatment to enhance the biocompatibility of the effluent. Evaluation of the toxicity and biodegradability of the effluent is necessary to couple solar photocatalysis and biological processes, although these measurements are usually difficult, because they are based on bioassays using living systems, and results may show a limited reproducibility and are difficult to understand. Three methods have been employed to determine toxicity. The main differences among these methods are the organism that is involved and their time of exposure to the pollutant. These assays are based on the inhibition of the bioluminescence of Vibrio fischeri and the specific respiration tax of activated sludge. The bioluminescent method has showed higher sensibility, although activated sludge-based respirometric measurements are expected to give more information on the behaviour of biological reactors. Biodegradability of the effluent has also been estimated according to three different assays; all of them involve activated sludge, although the time of adaptation to the pollutant is different: intrinsical biodegradability is measured according to Zahn-Wellens test, immediate biodegradability is obtained from the manometric respirometric assay and the direct biodegradability from the short time biological oxygen demand. Similar trends are obtained from all three methods, although quantitative differences can be appreciated in the estimated percentage of biodegradability. Effluents having very different composition and characteristics have been employed in this work; metal and cyanide containing wastewaters, obtained form electroplating industry, aqueous solutions of commercial pesticides and, finally, phenolic pollutants. All of them have been submitted to solar photocatalysis and their biocompatibility determined after different irradiation periods. 1.- INTRODUCCIÓN Estudio de la evolución de la toxicidad y biodegradabilidad de contaminantes persistentes en medios acuosos durante un proceso de fotocatálisis solar empleando diferentes técnicas analíticas 17 1.- INTRODUCCIÓN 1.1.- PROBLEMÁTICA DE LA CONTAMINACIÓN DEL AGUA En septiembre del año 2003, apareció publicado el 1º Informe de las Naciones Unidas sobre el Desarrollo de los Recursos Hídricos en el Mundo (The World Water Development Report), que reunió a 23 agencias del sistema de las Naciones Unidas y a otras entidades interesadas en la temática del agua dulce, y que contó con valiosas aportaciones de diversos gobiernos. En su análisis de la situación sobre los Recursos Hídricos del Mundo, los diferentes expertos consultados en esta ambiciosa tarea comenzaron su exposición con un capítulo muy significativo “La crisis mundial del agua” y expusieron su preocupación con el siguiente argumento: “La Tierra, con sus diversas y abundantes formas de vida, que incluyen a más de 6.000 millones de seres humanos, se enfrenta en este comienzo del siglo veintiuno con una grave crisis del agua. Todas las señales parecen indicar que la crisis está empeorando y que continuará haciéndolo, a no ser que se emprenda una acción correctiva. Se trata de una crisis de gestión de los recursos hídricos, esencialmente causada por la utilización de métodos inadecuados. La verdadera tragedia de esta crisis, sin embargo, es su efecto sobre la vida cotidiana de la población. La crisis pesa asimismo sobre el entorno natural, que cruje bajo la montaña de desechos que se vierten a diario y por el exceso de uso o uso indebido que de él se hace, con aparente desinterés por las consecuencias y por las generaciones venideras. En realidad, se trata fundamentalmente de un problema de actitud y de comportamiento, problemas en su mayoría identificables (aunque no todos) y localizables.” Resolver la crisis del agua es, sin embargo, sólo uno de los diversos desafíos con los que la humanidad se enfrenta en este tercer milenio y ha de considerarse en este contexto. Aún así, de todas las crisis, ya sean de orden social o relativo a los recursos naturales con las que nos enfrentamos los seres humanos, la crisis del agua es la que se encuentra en el corazón mismo de nuestra supervivencia y la de nuestro planeta. Aunque el agua es el elemento más frecuente en la Tierra, únicamente el 2,53% del total es agua dulce y el resto es agua salada. Aproximadamente las dos terceras partes del agua dulce se encuentran inmovilizadas en glaciares y al abrigo de nieves perpetuas. A la cantidad natural de agua dulce existente en lagos, ríos y acuíferos se agregan los 8.000 kilómetros cúbicos (km3) almacenados en embalses. 20 Introducción riesgo potencial a la salud pública (Bandala, E. R. 1998). Debido a sus características químicas, la mayoría de los plaguicidas son contaminantes orgánicos persistentes (COP) que resisten de forma variable la degradación química y bioquímica, por lo que su vida media en el ambiente puede ser elevada (Albert, L.A. 1998). Se ha demostrado su presencia en todos los medios receptores (aire, agua y suelo) así como en todos los niveles tróficos, desde el plancton hasta grandes mamíferos. Estos compuestos se bioacumulan en numerosas especies y aumentan su potencial tóxico y contaminante a medida que se desplazan a través de las redes tróficas (Organización Mundial de la Salud, 1998). Los informes de Naciones Unidas anteriormente mencionados, estiman que de todos los plaguicidas usados en la agricultura, menos del 1% alcanza los cultivos, mientras el resto termina contaminando principalmente el agua. Como estos contaminantes son habitualmente no biodegradables y sólo una pequeña cantidad de los residuos son tratados actualmente (por la carencia de tecnologías de tratamiento apropiadas disponible), existe un gran problema de acumulación. No obstante todas las características nocivas de estos compuestos, la venta de plaguicidas en todo el mundo aumenta sustancialmente cada año, principalmente en los países en vías de desarrollo. En concreto, en 1999, se han alcanzado las 23300 toneladas, en volumen, de insecticidas preparados solamente para uso agrícola (Instituto Nacional de Estadística, Geografía e Informática, INEGI, 2000). Otro ejemplo importante de los problemas relacionados con los plaguicidas se encuentra en las actividades de la agricultura intensiva, invernaderos, propias de los países industrializados. En el año 2000 se contabilizaron hasta unas 150000 hectáreas de invernaderos (Blesa, M.A. 2004) y se debe de tener en cuenta que esta actividad necesita aproximadamente unas 200 veces más plaguicidas que la agricultura tradicional. Así pues los problemas medioambientales asociados son una de las amenazas más críticas para el futuro de este sector, de relevancia económica importante en el mundo actual debido a la problemática del agua que afecta a la agricultura tradicional. Contaminación Industrial La industria es uno de los principales motores del crecimiento económico, especialmente en los países en vías de desarrollo. La Cumbre Mundial sobre Desarrollo Sostenible, celebrada en Johannesburgo en 2002, propuso un Plan de Acción que establece una estrecha relación entre los objetivos de desarrollo industrial, Estudio de la evolución de la toxicidad y biodegradabilidad de contaminantes persistentes en medios acuosos durante un proceso de fotocatálisis solar empleando diferentes técnicas analíticas 21 la erradicación de la pobreza y la gestión sostenible de los recursos naturales. Frenar la contaminación industrial significa mejorar la gobernabilidad medioambiental. Es posible disociar el desarrollo industrial de la degradación del medio ambiente, reducir drásticamente el consumo de recursos naturales y de energía y, al mismo tiempo, contar con industrias limpias y rentables. Para que dicho desarrollo sea sostenible, es importante contar con las disposiciones legales e institucionales necesarias. Ya existe un gran número de iniciativas de gobernabilidad de este tipo, tanto a nivel nacional e internacional, como en el sector industrial y en las empresas. Algunos de los convenios internacionales y acuerdos medioambientales multilaterales más recientes y fundamentales relativos al uso industrial del agua y a los impactos de la contaminación son: • El Convenio de Basilea sobre el control de los movimientos transfronterizos de desechos peligrosos y su eliminación (Convenio de Basilea, 1989). Este convenio provee un mecanismo internacional regulador de la generación, traslado, gestión y eliminación de residuos. • El Convenio de Estocolmo sobre Contaminantes Orgánicos Persistentes (COP) (Convenio de Estocolmo, 2001), que regula la producción, manipulación, transporte y uso de ciertas sustancias químicas orgánicas de alta toxicidad que permanecen intactas en el medio ambiente durante largos periodos de tiempo y que se dispersan por extensas áreas geográficas. • La Directiva Marco del Agua de la Unión Europea (Directiva 2000/60/CE, 2000), relativa a la gestión integrada de cuencas hidrográficas en Europa. La Directiva coordina los objetivos de la política europea del agua y protege el agua en todas sus formas, ya se trate de aguas superficiales o subterráneas. La Directiva, basada en la gestión por cuenca hidrográfica, también incorpora la Directiva relativa a la Prevención y al Control Integrados de la Contaminación (IPPC, por sus siglas en inglés), destinada a aquellas plantas industriales que registran un elevado potencial de contaminación. En vista de estos problemas y a fin de hacer frente a ellos, muchos países han adoptado el principio por el cual “el que contamina paga” o de precaución (Directiva 2004/35/CE, 2004), pero por otro lado suelen ser reticentes a obstaculizar el rendimiento industrial o económico o bien simplemente carecen de recursos para controlar y hacer cumplir los reglamentos. 22 Introducción Los acuerdos destinados a frenar la contaminación industrial del agua deben reflejarse en las políticas nacionales para que sean realmente efectivos. Las medidas reguladoras y económicas son necesarias para la gestión del agua a nivel local, regional y nacional. Éstas, son esenciales para seguir mejorando la productividad industrial del agua y reducir su contaminación. Dentro del propio sector industrial, se están haciendo esfuerzos para controlar la contaminación. En la última década, hubo un aumento exponencial en todo el mundo del número de empresas del sector industrial que trataron de obtener la certificación ISO 14001, norma medioambiental de carácter internacional, poniendo en marcha sistemas de gestión ambiental donde sus vertidos son gestionados mediante una evaluación del ciclo de vida. Cuando está en juego la calidad del agua, el vertido cero de efluentes debería ser el objetivo último de las empresas y las municipalidades (Directiva 1999/31/CE, 1999). El vertido cero de efluentes implica el reciclado del agua y la recuperación de todos los residuos, evitando el vertido de sustancias contaminantes al medio ambiente acuático. En el caso de que no resulte ni técnica ni económicamente factible, existe toda una serie de buenas prácticas intermedias que se pueden aplicar en las fábricas para reducir el impacto industrial sobre la calidad del agua. Estas incluyen: .- la evaluación de procesos de producción menos contaminantes; .- la Transferencia de Tecnologías Ecológicamente Racionales (estrategia promovida por la Organización de las Naciones Unidas para el Desarrollo Industrial, ONUDI); .- la separación de los distintos flujos de aguas residuales para evitar la mezcla de sustancias contaminantes; .- la recuperación de las materias primas y la energía a partir de los residuos; .- la selección de tecnologías óptimas para el tratamiento de las aguas residuales. Las aguas residuales industriales presentan características muy diferentes, dependiendo no sólo de las diversas clases de industrias que las generan, sino que varían incluso dentro de la misma industria. También son muy distintas las características de estas aguas residuales comparadas con las de aguas residuales domésticas muy semejantes en su composición, tanto cualitativa como cuantitativamente, dependiendo únicamente de la alimentación y del nivel de vida, higiene, etc. Esto hace que exista el peligro de simplificar el problema, intentando generalizar, y aplicar a las aguas residuales industriales las técnicas que se utilizan y están estudiadas para las aguas residuales de las poblaciones. El tratamiento de Estudio de la evolución de la toxicidad y biodegradabilidad de contaminantes persistentes en medios acuosos durante un proceso de fotocatálisis solar empleando diferentes técnicas analíticas 25 en las zonas costeras de esta comunidad. Así y todo, existen alrededor de 300 plantas, que producen alrededor de 12000 toneladas de aceite por año (Subirats Huerta S. y col., 1993). Esta producción está concentrada en las comarcas interiores, como son l’Alcoià y el Comtat. En la composición de los alpechines existe una elevada concentración de ácidos fenólicos, algunos de los cuales están considerados como residuos tóxicos y peligrosos (Callahan, M.A. y col., 1998). Los alpechines están constituidos por la fase acuosa formada en el proceso de obtención del aceite de oliva. Constan tanto de las aguas de vegetación de las aceitunas, como de las aguas empleadas en el lavado y en el proceso de extracción del aceite. En los países mediterráneos, la contaminación provocada por el alpechín destaca por su gravedad, siendo el volumen producido de hasta 10 millones de metros cúbicos por año (Fiestas Ros de Ursinos, J.A. y col., 1992). La composición es muy variable y depende mucho del sistema empleado en la obtención del aceite. Un análisis detallado de los distintos tipos de componentes orgánicos se muestra en la Tabla 1.1. compuesto Concentración (%) Grasas 0.02-1.0 Proteínas 1.2-2.4 Azúcares 2-8 Polialcoholes 1-1.5 Pectinas 0.5-1.5 Taninos y polifenoles 0.5-1 Otros 0.5-1.5 Tabla 1.1. Principales componentes orgánicos del alpechín. El contenido en fenoles es variable, con valores que oscilan entre los 3 y los 10 g/l. Estos valores dependen tanto del tipo de aceituna, como del periodo de maduración (disminuyen conforme avanza la campaña). El contenido en fenoles supera claramente los 500 ppm de polifenoles, cantidad a partir de la cual se considera que las aguas son difíciles de biodegradar (García García, P. y col., 1989), debido al carácter microbicida de los polifenoles. 26 Introducción Los fenoles presentes en las aceitunas se pueden dividir, según su estructura, en varios grupos (Vázquez Roncero, A. y col., 1974 y Ryan, D. y col., 1998); las estructuras de los principales se muestran a continuación (Tabla 1.2. y Figura 1.1). R3 R4 ácido H H cinámico H OH p-cumárico OH OH cafeico OMe OH ferúlico Figura 1.1 Estructura Química del Tabla 1.2. Compuestos derivados del ácido Ácido Cinámico cinámico (estructura es C6-C3). La reutilización de las aguas residuales es de vital importancia para el mantenimiento de los recurso hídricos. Las aguas residuales constituyen una importante fuente de agua de riego, ya que aproximadamente el 10% del total de las tierras de regadío de los países en desarrollo se utiliza este recurso. Esto beneficia directamente a los agricultores donde el agua es escasa, puede mejorar la fertilidad del suelo y reducir la contaminación de las aguas receptoras corriente abajo. Aunque las aguas residuales deberían recibir tratamiento para ser utilizadas como agua de riego, en países de bajos ingresos se usan frecuentemente en forma directa, sin tratar, con los riesgos que ello comporta en términos de exposición de trabajadores y consumidores a parásitos bacterianos, amébidos, virales y nematodos, así como a contaminantes orgánicos, químicos y de metales pesados. Las cosechas cultivadas con aguas residuales sin tratar no pueden exportarse y su acceso a los mercados locales está restringido, al menos parcialmente. 1.2.- PROCESOS DE TRATAMIENTO CONVENCIONALES DE AGUAS RESIDUALES Como se ha dicho en el aparatado anterior, a principios del siglo XXI, el problema de agua se considera como una importante amenaza. La escasez o carencia del agua afecta a más del 40 por 100 de la población mundial debido a razones políticas, COOH R4 R3 Estudio de la evolución de la toxicidad y biodegradabilidad de contaminantes persistentes en medios acuosos durante un proceso de fotocatálisis solar empleando diferentes técnicas analíticas 27 económicas y climatológicas. Además, más del 25 por 100 de la población mundial sufre problemas de salud e higiénicos a causa del agua. A pesar de los planes llevados adelante por la ONU en recientes años, 1100 millones de personas no tienen aún acceso a una mejora en el abastecimiento de agua y en el sanitario, especialmente concentrados en países subdesarrollados de África, Asia y América Latina (Baird, C., 1999). De otro lado, el uso doméstico y la actividad industrial, de gran impacto especialmente entre los países desarrollados, genera una gran producción de aguas residuales, las cuales causan un efecto directo sobre el medio ambiente de sus alrededores. Este hecho, unido a la necesidad de reutilizar el agua para nuevos usos, hace esencial proceder a la purificación de las aguas para conseguir el deseado grado de calidad. Debido al incremento de interés social y político por el respeto al medio ambiente, las líneas de investigación en la purificación del agua han tenido un gran crecimiento en las últimas décadas (Baird, C., 1999) La eliminación de los contaminantes presentes en las aguas subterráneas de mares, ríos y lagos, el control de la calidad del agua y la regulación frente al riesgo que provoca la contaminación son controlados de forma estricta en muchos países. Más recientemente, una reflexión sobre una nueva conciencia del medio ambiente, la Directiva Europea 2000/60/CE, fuerza la necesidad de adoptar medidas contra la polución del agua, encaminadas a conseguir una reducción progresiva de los contaminantes. Aunque la industria es el principal productor de agentes contaminantes, los consumidores también originan una degradación de medio ambiente: plaguicidas, fertilizantes, detergentes y otros son arrojados directamente sin depuración o a través de vertederos en algunas ocasiones incontrolados o elegidos inadecuadamente. Como consecuencia de todo esto más de 700 compuestos potencialmente peligrosos han sido identificados en efluentes y conducciones de agua. También hay que indicar que muchos compuestos pueden transformarse en sustancias potencialmente peligrosas durante el proceso de tratamiento de aguas, particularmente por halogenación, como es el caso de formación de organoclorados. El proceso de gestión de un residuo industrial, desde el momento de su generación, consta de las siguientes fases (Figura 1.2): 30 Introducción Tratamientos Biológicos. Son los más económicos y son válidos para muchos compuestos y residuos industriales considerados como peligrosos, pero no son útiles para los que por su propia naturaleza son tóxicos para los microorganismos, ya que esta situación inutiliza totalmente el posible tratamiento. Estos tratamientos suelen ir precedidos por un tratamiento físico y/o químico. Balsas de estabilización de residuos Digestión anaeróbica Compostaje Lodos activados Lagunas aireadas Tratamiento enzimático Filtros percoladores En la actualidad estos tratamientos se han extendido en un gran número de empresas de muchos sectores industriales importantes en la Comunidad Valenciana, como por ejemplo en la Industria Textil (Crespi, M., 1994), y es la más recomendable para el tratamiento de aguas residuales municipales e industriales en general (Metcalf, E., 2003). Procesos como el Biorreactor de membrana (BRM) están mejorando considerablemente los tratamientos biológicos (Adham, S. y col. 2005). Incorporan membranas de microfiltración e ultrafiltración y eliminan el decantador secundario de un proceso biológico convencional, con lo que permiten mejorar el control de la actividad biológica y operar a mayores cargas orgánicas (Cicek, N. 2003). Otras tecnologías de tratamientos biológicos utilizadas como el Reactor Batch secuenciado (SBR) también está siendo ampliamente utilizado en la actualidad, ya que proporciona mayor flexibilidad en el proceso biológico (Fitzgerald, K. S., 2005). Sin embargo, en algunos casos como aguas residuales de industrias de recubrimientos metálicos (con altos contenidos en cianuros), así como aquellas que contengan plaguicidas, estos procedimientos resultan inadecuados pues la toxicidad de esta agua es muy elevada, produciendo la eliminación total o parcial de la flora bacteriana y la inutilización del proceso biológico. El empleo de tratamientos biológicos para la depuración de los alpechines se encuentra con el problema de la presencia de elevadas concentraciones de compuestos fenólicos, tóxicos, inhibidores o refractarios a la acción de la mayoría de los microorganismos. Una posibilidad sería diluir los alpechines en una gran proporción de modo que la concentración de fenoles descienda. También se les puede someter a un tratamiento físico sencillo como puede ser la congelación, destilación, filtración o ultrafiltración (Hamdi, M. y col., 1992). Estudio de la evolución de la toxicidad y biodegradabilidad de contaminantes persistentes en medios acuosos durante un proceso de fotocatálisis solar empleando diferentes técnicas analíticas 31 Se pueden utilizar también tratamientos aerobios utilizando fangos activos que han sido previamente aclimatados a los alpechines (Maestro Duran, R. y col., 1991), o bien empleando microorganismos especiales como el Aspergillus terreus, capaz de degradar los compuestos fenólicos del alpechín (Martínez Nieto, L. y col., 1992). Por último, es posible el empleo de tratamientos anaerobios con la producción de metano entre otros compuestos orgánicos (Beccari, M. y col., 1999). En estos casos y cada vez más crecientemente, se está recurriendo en los países industrializados al uso de las llamadas Tecnologías Avanzados de Oxidación (TAOs) o Procesos Avanzados de Oxidación (PAOs), muchas veces nombradas por sus siglas en inglés AOPs (Advanced Oxidation Processes). La mayoría de estas tecnologías pueden aplicarse a la detoxificación de aguas con problemas de toxicidad y biodegradabilidad, generalmente en pequeña o mediana escala. Pueden usarse solas o combinadas entre ellas o como tratamientos previos a los métodos convencionales, pudiendo ser aplicadas además de a las aguas, también a contaminantes que se encuentran en el aire y en el suelo. Los Procesos Avanzados de Oxidación han experimentado un gran desarrollo en las últimas décadas, y han suscitado gran interés en la comunidad científica internacional. Se investigan tratamientos con todo tipo de oxidantes: ozono, peróxidos, procesos Fenton, fotocatálisis, etc. 1.3.- PROCESOS AVANZADOS DE OXIDACIÓN APLICADOS AL TRATAMIENTO DE AGUAS RESIDUALES Como se ha dicho en puntos anteriores, los Procesos Avanzados de Oxidación (PAOs) son procesos fisicoquímicos capaces de producir cambios profundos en la estructura química de los contaminantes (Legrini, O. y col., 1993; Bolton, J. R. y col., 1994; Gogate, P. R. y col., 2004a). El concepto fue inicialmente establecido por Glaze y sus colaboradores (Glaze, W. H y col., 1987), quienes los definieron como procesos que involucran la generación y uso de especies transitorias poderosas, principalmente el radical hidroxilo OH•. Este radical puede ser generado por medios fotoquímicos, incluida la luz solar (Malato y col., 2003) o por otras formas de energía, y posee alta efectividad para la oxidación de materia orgánica. Algunos PAOs, como la fotocatálisis heterogénea, la radiólisis y otras técnicas avanzadas, son también capaces de generar reductores químicos que permiten 32 Introducción realizar transformaciones en contaminantes tóxicos difíciles de oxidar, como iones metálicos o compuestos halogenados (Blesa, M. A. y col., 2004). Los PAOs pueden clasificarse en función de la necesidad de la participación de la luz como, procesos no fotoquímicos, y procesos fotoquímicos. Procesos no fotoquímicos: Ozonización. Ozonización con H2O2/O3. Procesos Fenton (Fe2+/H2O2) y relacionados. Oxidación electroquímica. Radiólisis y tratamiento con haces de electrones. Plasma no térmico. Descarga electrohidráulica y ultrasonidos. Oxidación en agua sub/y supercrítica. Procesos fotoquímicos: Ultravioleta de vacío. UV/H2O2 . UV/O3. Foto-Fenton y relacionadas. Fotocatálisis heterogénea con semiconductores. Empleo de sensibilizadores orgánicos o complejos de metales de transición. Además de los incluidos en la lista, otros métodos oxidativos, como la oxidación electroquímica (Flox C. y col., 2006), podría incluirse entre los PAOs, aunque generalmente se les considere un grupo aparte. Otras tecnologías que pueden incluirse también entre las PAOs son los tratamientos con barreras permeables reactivas de Fe metálico (Deng, B. y col., 1999; Deng, N. y col., 2000) y la Oxidación con K2FeO4 (Sharma, V. K. y col., 2004). Algunas de las ventajas de estas nuevas tecnologías sobre los métodos convencionales se indican a continuación: Transforman químicamente el contaminante en otra especie menos tóxica y más biodegradable, llegando en algunos casos a su total mineralización. No hay generación de fangos que requieran tratamiento y/o eliminación. Emplean como reactivos unas sustancias baratas y no tóxicas. Permiten transformar los contaminantes recalcitrantes en productos tratables por métodos más económicos como el tratamiento biológico (Acher, A. y col., 1990). Generalmente mejoran las propiedades organolépticas del agua tratada. Son útiles para disminuir la concentración de compuestos formados por pre- tratamientos alternativos, como la desinfección (Milow, B. y col., 1999) Estudio de la evolución de la toxicidad y biodegradabilidad de contaminantes persistentes en medios acuosos durante un proceso de fotocatálisis solar empleando diferentes técnicas analíticas 35 Finalmente, los otros procesos no fotoquímicos como la Radiólisis γ y procesos con haces de electrones, el Plasma no térmico, la Descarga electrohidráulica con Ultrasonido (Cavitación Electrohidráulica) y la Oxidación en agua sub/y supercrítica (WAO y CWAO) presentan un elevado coste de instalación y de mantenimiento, por lo que su uso se está aplicando preferentemente a residuos muy especiales. 1.3.2- PROCESOS FOTOQUÍMICOS La excelente capacidad de los radicales hidroxilos para oxidar compuestos orgánicos sugiere también la utilidad de estudiar su generación fotoquímica. Las procesos fotoquímicos ofrecen muchas ventajas en el tratamiento de aguas y efluentes que no se limitan al aprovechamiento del HO• como oxidante (Gogate, P.R. y col., 2004 a; 2004b;). Sin embargo la eficiencia de la eliminación fotoquímica de un determinado compuesto puede alterarse drásticamente en función del diseño del reactor (tipo de lámpara, geometría, hidrodinámica, etc.), lo que incide sobre el consumo de energía eléctrica y los costos (Blanco, J. y col., 1999). Los PAOs fotoquímicos no son adecuadas para procesar mezclas de sustancias de elevada absortividad, o con altos valores de sólidos en suspensión, pues la eficiencia cuántica disminuye por pérdida de luz, por dispersión y/o absorción competitiva (Gogate, P.R. y col., 2004a; 2004b). La Fotólisis del agua en el ultravioleta de vacío (UVV) aprovecha la irradiación a longitudes de onda menores de 190 nm (UV-C) para obtener la mineralización de contaminantes resistentes como el plaguicida atrazina (González, M.C. y col., 1994 y 1995; Fung, P.C. y col., 1999; Braun y col., 2004). Sin embargo, requiere suministrar oxígeno, utilizar material de cuarzo y una fuente de alta potencia, lo que encarece los costes. La radiación UV-C ha sido ampliamente utilizada para el tratamiento de aguas residuales (Legrini y col., 1993). Los procesos UV/H2O2 así como los UV/O3 son procesos fotoquímicos muy útiles para la potabilización de aguas y el tratamiento de aguas altamente contaminadas (Pera-Titus y col., 2004; Gogate P. y col., 2004a). También puede utilizarse la combinación UV/H2O2/O3 (Glaze W.H. y col, 1987). 36 Introducción Algunos procesos fotoquímicos son capaces de actuar en la región UV-A y visible del espectro electromagnético; esto significa que pueden aprovechar de manera eficiente la luz solar que llega a la superficie terrestre, con las ventajas económicas y ecológicas que esto conlleva. La radiación que proviene del sol posee una potencia de 1.7·1014 kW, casi 30000 veces la potencia consumida en todo el mundo. El espectro de longitudes de onda que llegan a la alta atmósfera se encuentra entre 200 y 50000 nm, pero la absorción de los diversos compuestos presentes en la atmósfera como el dióxido de carbono, ozono, oxígeno y vapor de agua, reducen la radiación que llega a la superficie de la Tierra a un intervalo entre 290 y 3000 nm, según se puede ver en la Figura 1.3 (Malato, S. 1999). Figura 1.3. Espectro de la radiación solar en la superficie de la tierra Entre los procesos de oxidación avanzada que son capaces de utilizar la luz solar, los más utilizados se pueden incluir dentro de 3 grandes grupos (Malato S. y col., 2003, Blanco-Gálvez J. y col., 2007): a) Proceso foto-Fenton y similares b) Sólidos semiconductores c) Fotosensibilizadores orgánicos Estudio de la evolución de la toxicidad y biodegradabilidad de contaminantes persistentes en medios acuosos durante un proceso de fotocatálisis solar empleando diferentes técnicas analíticas 37 1.3.2.A.- REACTIVO DE FENTON Y PROCESOS FOTOFENTON El reactivo de Fenton consiste en el uso de una mezcla de sales de hierro (II) y peróxido de hidrógeno (Pignatello J.J. y col., 1999 y 2006). Aunque el mecanismo no está completamente elucidado, se cree que las sales de hierro descomponen el agua oxigenada según un mecanismo catalítico, formando radicales hidroxilo (Ecuaciones 1.1 y 1.2) Fe2+ + H2O2 ⎯→ Fe3+ + OH- + ·OH (Ecuación 1.1) Fe3+ + OH- ⎯→ Fe2+ + ·OH (Ecuación 1.2) La reacción de reducción del Fe(III) es muy lenta, lo que representa una pérdida de eficiencia del proceso. Para acelerar el proceso se puede irradiar la disolución (Ecuación 1.3), con lo que el proceso pasa a ser foto-Fenton (Kim, S.M. y col., 1998; Bossmann, S.H. y col., 1998). El pH óptimo de esta última reacción está próximo a 3 ya que es aquí donde se alcanza la mayor concentración de la principal especie fotoactiva, el Fe(OH)2+ (Bossmann, S.H. y col., 1998); al absorber en el rango 290- 410 nm, la radiación solar también puede ser empleada para acelerar el proceso. Fe(OH)2+ + hν Fe2+ + HO• (Ecuación 1.3) Hay que mencionar que se han presentado algunos trabajos en donde se menciona la aparición de iones ferratos y ferrilos (+IV y +V respectivamente) formando complejos intermedios en las reacciones de los procesos foto-Fenton (Bossmann, S.H. y col., 1998; Pignatello, J.J. y col., 1999). También cabe indicar que algunos autores han descrito importantes efectos negativos, en presencia de iones carbonato y fosfato, en la reacción Fenton aunque la presencia de otros iones como cloruros o sulfatos no afectan de modo tan significativo (Kiwi, J. y col., 2004; De Laat, J. y col., 2004; Maciel, R. y col., 2004). La reacción foto-Fenton se introdujo a principio de los 90 como tecnología de tratamiento de aguas residuales (Lipczynska-Kochany, E. 1991; Sun, Y. y col., 1993b; Kiwi, J. y col., 2004). Más tarde fue aplicada en aguas que contenían diferentes contaminantes, como plaguicidas (Fallamann, H. y col., 1999; Huston, P.L. y col., 1999; Malato, S. y col., 2003; Hincapié, M.M. y col., 2005), clorofenoles (Pera-Titus, M. y col., 2004), contaminantes fenólicos (Herrera, F. y col., 1998; Gernjak, W. y col., 40 Introducción La fotocatálisis con dióxido de titanio ha sido ampliamente empleada en la degradación de diferentes contaminantes, entre los que destacan los textiles (Morrison C. y col., 1997, Zhao J. y col., 1998; Konstantinou I.K., y col., 2002; Lizama y col., 2002), plaguicidas (Konstantinou I.K., y col., 2003; Pizarro P. y col., 2005), clorofenoles (Pera-Titus y col., 2002), compuestos fenólicos (Bacsa, R.R. y col., 1998; Marques, P.A.S.S. y col., 1996) o aguas cianuradas (Bozzi, A. y col., 2004; Dabrowski, B. y col., 2002; Augugliano, V. y col., 1999). 1.3.2.C.- SENSIBILIZADORES ORGÁNICOS Aunque tanto el reactivo de Fenton como el TiO2 han demostrado ser buenos fotocatalizadores, empleando luz solar, es conveniente el estudio de otras sustancias que sean capaces de absorber de forma más eficiente la región visible del espectro solar. Algunas de las sustancias más prometedoras en este sentido son los fotosensibilizadores orgánicos, algunos de los cuales han sido ya estudiados en otros campos de la química o de la medicina (Miranda, M.A. y col., 1994, 2000 y 2001; Teuber, M. y col., 2001). Existen dos principales grupos de fotosensibilizadores clasificados según su mecanismo de reacción como se explica seguidamente: • Transferencia energética. En los que los fotosensibilizadotes toman la energía luminosa y posteriormente la transfieren al sustrato facilitando de esta forma la reacción. Un ejemplo de estos compuestos es el azul de metileno o el rosa de bengala (Miller, J.S. 2005). • Transferencia electrónica. Se produce una transferencia de electrones entre el catalizador y el sustrato (Miranda, M.A. y col., 1994); se trata de un proceso similar al descrito para el dióxido de titanio (Dionysiou, D.D. y col., 2000) Este segundo grupo de fotosensibilizadores está demostrando ser el más eficaz, y entre ellos uno de los más utilizados actualmente es el catión 2,4,6-trifenilpirilio. El catión 2,4,6-trifenilpirilio (Figura 1.5) es un sensibilizador orgánico utilizado en química fina (Miranda M.A. y col., 1994) y que se puede utilizar como fotocatalizador ya que es capaz de absorber en la región UV-A del espectro electromagnético. Estudio de la evolución de la toxicidad y biodegradabilidad de contaminantes persistentes en medios acuosos durante un proceso de fotocatálisis solar empleando diferentes técnicas analíticas 41 O Ph PhPh + Figura 1.5. Catión 2,4,6-trifenilpirilio Este catión presenta en disolución acuosa un espectro de absorción con bandas muy intensas en la región visible y ultravioleta cercano (Gráfica 1.1) con máximo de absorbancia a 350 y 400 nm, llegando a absorber hasta los 450 nm. Esto indica que este compuesto puede absorber una parte importante de la radiación solar y por lo tanto actuar como fotocatalizador solar. 0 0,5 1 1,5 2 300 350 400 450 500 longitud de onda (nm) ab so rb an ci a (A .U .) Gráfica 1.1. Relación de la velocidad de reacción con la intensidad solar El catión 2,4,6-trifenilpirilio (TPP+) no es un oxidante fuerte en su estado fundamental, pero sí lo es en su estado excitado, de modo que actúa a través de un mecanismo de transferencia electrónica, generándose el radical piranilo y un catión radical procedente del contaminante. La reacción de este intermedio con el oxigeno molecular produce la fragmentación u oxidación del sustrato contaminante (Miranda, M.A. y col., 1999, 2000, 2001 y 2004). Una representación del proceso en su conjunto se puede ver en la Figura 1.6, donde se puede observar el ciclo de reducción/oxidación que sufre en TPP+ (Arques, A. 2001; Amat, A.M. y col., 2002). 42 Introducción O Ph PhPhO Ph PhPh O2 O2 COOH OH COOH OH - +· Luz ·+ Figura 1.6. Mecanismo de la actuación del catión 2,4,6-trifenilpirilio como fotocatalizador solar. El catión 2,4,6-trifenilpirilio ha sido probado con éxito como fotocatalizador solar en el tratamiento de algunos compuestos contaminantes, en concreto, derivados del ácido cinámico y del ácido benzoico (Miranda, M.A. y col., 2001). Estos compuestos se encuentran presentes en muchas aguas residuales industriales, como las agroalimentarias y son difíciles de tratar por métodos convencionales. También se ha mostrado eficaz en el tratamiento de algunos compuestos fenólicos presentes en aguas industriales. Sin embargo presenta algunos problemas como dificultad de recuperación de las aguas tras el tratamiento, baja estabilidad en disoluciones acuosa (Miranda M.A. y col., 2001), probable contaminación de las aguas por la presencia del catalizador solubilizado. Una posible solución a los inconvenientes podría consistir en el empleo de la catálisis heterogénea para lo que necesitamos un soporte sólido donde depositar el catalizador. Entre los soportes a emplear se encuentran algunas materias inorgánicas como el gel de sílice (Miranda y col, 2002) o algunos silicatos que le permiten actuar como fotocatalizador y no intervienen en las reacciones fotodegradativas. Las zeolitas y las sepiolitas entre otros son algunos de estos materiales que hoy día se están utilizando (Amat, A.M. y col., 2003a, 2004 y 2005a). Sin embargo, no solamente se han utilizado las sales de pirilio con fines ambientales, sino también existen ejemplos de otros sensibilizadores como las sales de tiopirilio Estudio de la evolución de la toxicidad y biodegradabilidad de contaminantes persistentes en medios acuosos durante un proceso de fotocatálisis solar empleando diferentes técnicas analíticas 45 ambiental, pues puede afectar por una parte a la biodegradación orgánica del agua residual, inhibiéndola, y por otra a la eficiencia de la reducción de la fase líquido-sólida, lo que modificará las propiedades de los fangos, afectando consecuentemente a la calidad del efluente final. Como consecuencia se han desarrollado un amplio abanico de bioensayos de toxicidad para establecer estos niveles en efluentes acuosos. Se ha buscado en estos métodos la rapidez, sencillez, sensibilidad y, al mismo tiempo, un bajo coste. No siempre se ha conseguido todo lo propuesto, pero en algunos casos este planteamiento ha sido efectivo. En pos de identificar los principales componentes tóxicos en efluentes y fangos, se recomienda la combinación de ensayos biológicos de toxicidad con análisis químicos de los compuestos (Ruiz, M.J. y col. 1997). La respuesta biológica inducida en diferentes organismos vivos por una sustancia química es muy diversa y depende de su sensibilidad frente a los contaminantes. Los bioensayos pueden proporcionar una medida general del impacto tóxico de efluentes consistentes en una mezcla compleja de sustancias químicas, integrando diferentes factores como el pH, la solubilidad, los procesos de antagonismo o sinergismo, la bioacumulación, etc. El uso de diversas bacterias en los bioensayos que engloban diferentes especies bioindicadoras y distintos niveles tróficos es una forma eficiente y esencial para detectar sustancias peligrosas en los ecosistemas acuosos. Algunos bioensayos usados comúnmente se han sustituido por otros microbianos y biosensores (Tothill, L.E. y col., 1996). Los procesos analíticos clásicos de toxicidad directa son, en general, demasiado laboriosos para ser rápidamente aplicables; por lo que el uso de sistemas de test biológicos rápidos para evaluar la toxicidad, basados en células o microorganismos, abre nuevas expectativas (Reemtsma, T. y col., 2001). Estos nuevos test pueden medir la toxicidad por los efectos sobre las células vivas o directamente sobre órganos, de forma rápida, con bajo coste económico y sin los problemas éticos que conllevan la utilización de organismos superiores como los peces. Los bioensayos para medir la toxicidad pueden ser clasificados según la especie utilizada en el test. Los organismos normalmente utilizados en bioensayos de toxicidad se reflejan en la Tabla 1.4 (Farré, M. y col., 2003). 46 Introducción Principales organismos empleados en bioensayos de toxicidad Agua dulce Vertebrados Invertebrados Agua templada Agua fría Agua templada Agua fría Especies Etapa de la vida Ref. Especies Etapa de la vida Ref. Especies Etapa de la vida Ref. Especies Etapa de la vida Ref. Ictaluros punctatus 1-90 días (a) (b) Oncorhyncus kisutch 30-90 días (a) (b) Cambarus spp Procambarus spp juvenil (a) (b) Pacifastus leniusculus juvenil (a) (b) Pimephales promelas 1-90 días (a) (b) Salmo gairneri 30-90 días (a) (b) (c) Chironomus spp larva (a) (b) Pteronarcys spp larva (a) (b) Leopomis machrochirus 1-90 días (a) (b) Salvelinus fontanalis 30-90 días (a) (b) Hexagenia limbata Hexagenia Bilineata ninfa (a) (b) Bateis spp ninfa (a) (b) Hyalalla spp Gammarus lacustris Gammarus fasciatus juvenil (a) (b) Daphnia magna Daphnia pulex Cerodaphnia spp 1-24 h (b) (e) (f) (g) Agua marina y de estuario Vertebrados Invertebrados Agua templada Agua fría Agua templada Agua fría Especies Etapa de la vida Ref. Especies Etapa de la vida Ref. Especies Etapa de la vida Ref. Especies Etapa de la vida Ref. Paralichthys dentatus Paralichtys Lethostigma 1-90 días (a) (b) Citharichthys- stigmaeus 1-90días (a) (b) Panaeus setiferus Panaeus Duorarum Panaeus Post- larva (a) (b) Strongylocen- trotus purpuratus Gameto/ embrión (a) (b) Fundulus similes 1-90 días (a) (b) Pheudopleu- ronectes Smericanus Post- metamorfosis (a) (b) Neomysis spp. 1-5 días (a) (b) Strongylocen- trotus droebachiensis Gameto/ embrión (a) (b) Fundulus heteroclitus 1-90 días (a) (b) Parophyrys vetulus 1-90 días (a) (b) Callinectes sapidus juvenil (a) (b) Pandalus jordani Juvenil (a) (b) Langodon rhomboids 1-90 días (a) (b) Palaemonetes spp. 1-10 días (a) (b) Cancer magíster Juvenil (a) (b) Cyprinodon variegates 1-90 días (a) (b) Grangon spp. Post- larva (a) (b) Dendraster exentricus Gameto/ embrión (a) (b) Mendía spp. 1-90 días (a) (b) Crassostrea gigas Post- larva (a) (b) Leiostomus xanthurus 1-90 días (a) (b) Crassostrea virginica Embrión/ larva (a) (b) (a) Tothill, L.E. y col., 1996 (b) EPA/600/4-90/027F,1993 (c) ISO 10229, 1994 (e) Persoone, G. y col., 1994 Estudio de la evolución de la toxicidad y biodegradabilidad de contaminantes persistentes en medios acuosos durante un proceso de fotocatálisis solar empleando diferentes técnicas analíticas 47 (f) Biesinger, K.E. y col., 1987 (g) ISO 6341, 1996 Plantas y algas Especies Parámetros de medida Ref. Algas Selenastrum capricornutum Pseudokirchneriella subcapitata Inhibición del crecimiento Inhibición del crecimiento (1), (2) Dunaliella tertiolecta Inhibición del crecimiento (2) Skeletonema costatum Inhibición del crecimiento (3) Phaedactylum tricornutum Inhibición del crecimiento (1) Plantas Brassica campestris Germinación (1) Avena sativa Germinación (1) Latuca sativa Longitud de raíz (1) Microorganismos Especies Parámetros de medida Ref. Vibrio fischeri Bioluminiscencia (4) Photobacterium Phosphoreum Bioluminiscencia (4) Escherechia coli Estado Metabólico (5) Pseudomonas putida Estado Metabólico (5),(6) Pseudomonas fluorescens P-17 Inhibición del crecimiento Bioluminiscencia (7) Spirilium volutanta Movilidad (8) Cyanobacter synechicocus Actividad fotosintética (9) Fangos activos Crecimiento (4) Staphylococus aureus Crecimiento (7) Sacharomysces cerevisiae Actividad Metabólica (10) (1) Ferrari, B. y col., 1999 (2) EPA-600/9-78-018, 1978 (3) ISO 10253, 1995 (4) ISO 11348-1, 2 y 3, 1998 (5) Evans, M.R. y col., 1998 (6) Farré, M. y co., 2003 (7) Zhang, S. y col., 2001 (8) Nomura, Y. y col., 1994 (9) ISO 15522, 1999 (10) Palmquist, E. y col., 1994 Tabla 1.4. Principales organismos empleados en bioensayos de toxicidad Bioensayos con peces. Usados de forma habitual, los ensayos de toxicidad con peces incluyen la exposición del organismo a la sustancia tóxica por un máximo de 96 horas. Los resultados se obtienen como el porcentaje en volumen que es letal para el 50% de los organismos (LC50). Se utilizan preferentemente dos tipos de test de toxicidad acuática, estático o con flujo. La selección del tipo de test depende de los objetivos del test, de los recursos que se tienen, de los requerimientos del organismo test y de las características del efluente. Especies como Salmo gairdneri (ISO 10229, 1994) y Pimephales promelas se han utilizado tradicionalmente para los test de crecimiento y de letalidad aguda (EPA-600/4-90/027, 1993). 50 Introducción Se han descrito varios bioensayos y se han estudiado diferentes métodos usando distintos microorganismos, que pueden ser clasificados dependiendo del parámetro de medida que se utilice. Hay tests basados en la inhibición del crecimiento celular como los que utilizan Pseudomonas (ISO 10712, 1995) o los que se basan en la inhibición de la respiración de una mezcla de microorganismos que utilizan fangos activos (ISO 15522, 1999 y OCDE 209). Ensayos respirimétricos basados en la inhibición de la respiración de fangos activos. La respirometría como medida de la inhibición de la respiración de fangos activos ha sido utilizada para medir la toxicidad de aguas residuales, tanto para bacterias heterotróficas como para bacterias nitrificantes (Riedel, K. y col., 2002). La respirometría de fangos activos es un método directo normalizado para analizar la actividad de los fangos y su toxicidad, estando bien documentado en la literatura científica (por ejemplo, Mrafkova y col., 2003). Se basa principalmente en que la tasa de respiración de un fango activado puede ser reducida en presencia de contaminantes. La medida más común de esa tasa de respiración es la tasa de respiración promedio. Con referencia a la inhibición de la respiración de fango activos, respirometría, la toxicidad se evalúa en términos de descenso de la tasa de respiración específica máxima (OUR máx, del inglés “oxygen uptake rate”), referida a un compuesto muy biodegradable como el acetato y su evolución detectada después de la adición de concentraciones conocidas de los compuestos tóxicos. El porcentaje de inhibición (%inh) se obtiene en forma de curva en función de la concentración del tóxico utilizada y a partir de ésta se puede obtener el valor de la CE50. El fango activo suele ser obtenido a partir de una estación depuradora de aguas residuales, mantenido en aireación, y a poder ser que no esté preadaptado, es decir, que no esté en contacto con el contaminante objeto de estudio. El método de toxicidad basado en la inhibición de la respiración de los fangos activos es un método de referencia ya que es simple, tiene una buena reproducibilidad y los microorganismos son representativos de la biomasa que se encuentra en una estación de tratamientos de aguas residuales. El intervalo de tiempo considerado para la detección de la inhibición de la respiración de los fangos activos utilizados en los procedimientos del test es muy corto (≤ 10 min) para evitar cualquier interferencia causada por la biodegradación de los compuestos utilizados. Estudio de la evolución de la toxicidad y biodegradabilidad de contaminantes persistentes en medios acuosos durante un proceso de fotocatálisis solar empleando diferentes técnicas analíticas 51 La concentración de biomasa del fango activo se debe medir para cada ensayo, utilizando para ello el test de sólidos volátiles en suspensión. La biomasa óptima y las concentraciones de acetato y oxígeno están establecidas de antemano (Ricco, G. y col., 2004), con el objetivo de evitar la reoxigenación de la muestra durante el test, evitar los efectos perjudiciales de una elevada concentración de oxígeno disuelto en la actividad de la biomasa, trabajar con una proporción sustrato/biomasa (S/X) baja para reducir la modificación del cultivo durante el test y asegurarse un consumo de oxígeno detectable. La continua aireación en el respirómetro abierto causa problemas relacionados con compuestos orgánicos volátiles. Para evitar este problema, se han realizado una serie de cambios en el equipo experimental y en el procedimiento del test. Se ha utilizado un respirómetro cerrado con una muy pequeña cámara de aire en la parte superior, lo que hace posible suponer una casi nula transferencia de masa del gas a la fase líquida y hace innecesario evaluar el coeficiente de transferencia gas-líquido (KLa). Consecuentemente, la respiración de la biomasa puede evaluarse sólo con la concentración de oxígeno detectada en la fase líquida (Ricco, G. y col., 2004). Bioluminiscencia El más común de los tests de toxicidad que utilizan bacterias está basado en la inhibición de bacterias luminiscentes, sobre todo Vibrio fischeri (Photobacterium phosphoreum) (Boluda, R. y col. 2002, Abbondanzi, F. y col. 2003, Parvez, S. y col. 2006), aunque también existen algunos métodos basados en otra bacteria marina como Vibrio harveyi (Mariscal, A. y col. 2003) e incluso con cadenas manipuladas genéticamente de Escherichia coli (Kaiser, K.L.E. 1998a). Existen en el mercado diferentes equipos comerciales basados en la inhibición de la luminiscencia de ese tipo de bacterias como por ejemplo MICROTOX®, BIOTOX®, LUMISTOX® o TOXALERT®, que utilizan la metodología estandarizada según normas DIN o ISO, con un alto nivel de reproducibilidad y fácil manipulación (ISO 11348-1-2-3, 1998). Estas bacterias marinas emiten luz de forma natural gracias a un enzima, la luciferasa bacteriana, cuya catálisis sigue la siguiente reacción general (Ecuación1.8): LUZOHCOOHRFMNHCOROFMNH bluciferasaa ++−+⎯⎯⎯ →⎯−−++ 222 (Ecuación 1.8) aFMNH2 (Flavinmononucleótido hidrogenado) bFMN (Flavinmononucleótido deshidrogenado) 52 Introducción La producción de luz es directamente proporcional al estado metabólico de la célula y cualquier inhibición de la actividad celular se refleja en un decrecimiento de la bioluminiscencia. El porcentaje de inhibición (%inh) se determina comparando la respuesta dada por una solución de control, en medio salino, con la correspondiente a la muestra después de añadir la sustancia tóxica. La inhibición de la bioluminiscencia se puede definir como muestra la Ecuación 1.9: 100 control luz muestra luz1%inh ×⎟ ⎠ ⎞ ⎜ ⎝ ⎛ −= (Ecuación 1.9) Cualquier interferencia metabólica debida a una inhibición química modificará la cantidad de luz emitida. La toxicidad acuosa se expresa en EC50, que consiste, en este caso concreto, en la concentración efectiva de una sustancia tóxica que produce una reducción de luz del 50%. Las principales ventajas de los test de bioluminiscencia son la rapidez, sensibilidad y reproducibilidad de los ensayos, aunque también presentan algunas desventajas. La más importante de ellas es que, puesto que Vibrio fischeri es una bacteria marina, se necesita una filtración previa de la muestra y trabajar con disoluciones salinas. Debido a esta salinidad, algunas sustancias orgánicas reducen su, ya de por sí baja, solubilidad en agua provocando importante turbiedad en la muestra lo que puede llevar a errores importantes en la medida de la luz emitida. Para evitar este problema, se puede añadir metanol, hasta un máximo de un 10%, a la disolución salina (Farré, M. y col., 2003). Cuando se ha utilizado el ensayo con Vibrio fischeri para analizar la toxicidad de las aguas residuales, se ha comprobado que es, en un gran número de casos, mucho más sensible que la inhibición de la respirometría de fangos activos, y esto dificulta la aplicación de esta técnica al control en las plantas de tratamientos de aguas municipales. Por todo ello, en los últimos años se han propuesto algunas modificaciones para el ensayo con Vibrio fischeri, como por ejemplo utilizar, en el ensayo con Microtox®, la suspensión de células de la bacteria marina acoplada a una matriz de fangos activos (Hoffmann, C. y col., 2001). Los autores encontraron que esta modificación reducía la sensibilidad del ensayo, haciéndola comparativa a la respirometría de fangos activos, debido sobre todo a los fenómenos de adsorción de contaminantes que se producían en la superficie de la matriz de fangos. También Lappalainen, J. y col., 2001 Estudio de la evolución de la toxicidad y biodegradabilidad de contaminantes persistentes en medios acuosos durante un proceso de fotocatálisis solar empleando diferentes técnicas analíticas 55 sistema amperométrico (Evans, M.R. y col., 1998). Este último test utiliza un medidor químico para desviar electrones del sistema respiratorio de la bacteria inmovilizada físicamente en el biosensor, a un electrodo amperométrico de carbono a 550 mV con respecto al electrodo de referencia Ag/AgCl. Las medidas realizadas con biosensores no son distorsionadas por la turbidez de la muestra, siendo una ventaja importante sobre todo a la hora de realizar ensayos in situ en aguas residuales. Como desventaja hay que decir que las muestras deben de estar libres de sustancias que puedan precipitar o ensuciar el electrodo (aceites y grasas por ejemplo), así como no contener sustancias abrasivas que puedan dañar o eliminar la membrana que contiene inmovilizado el organismo utilizado en el biosensor. También es de destacar la escasa reproducibilidad y sensibilidad de los biosensores para determinadas sustancias tóxicas. En la actualidad, se ha comprobado que la combinación de algunas de estos métodos de ensayo es más eficaz para evaluar la toxicidad. En los casos en los que es conveniente monitorizar y controlar la evolución de la toxicidad, por ejemplo en el caso de producirse procesos de biodegradación que puedan dar lugar a intermedios de reacción tóxicos, es muy conveniente utilizar técnicas complementarias para determinar este parámetro tan crítico. Algunos ensayos usan biosensores para medir la inhibición de la tasa de respiración y detectar la toxicidad en aguas residuales. Liao, J.D. y col., 2001, describen un biosensor basado en la inhibición de la respiración de bacterias sensibles al oxígeno (cadenas no especificadas) en fangos activos. Cuando la respiración de la bacteria es inhibida debido a los contaminantes, más oxígeno es capaz de atravesar la membrana del biosensor provocando un cambio en el potencial redox de la membrana. El tiempo de respuesta es muy corto, de aproximadamente 8 minutos. Los autores encontraron que existe una buena correlación entre las señales del biosensor (cambio en el potencial redox) con la medida de la tasa de respiración. Otro biosensor similar al anterior ha sido descrito por Tzoris, A. y col., 2002, el Baroxymeter. En este biosensor la inhibición de la respiración de la bacteria, en este caso Pseudomona pútida, es cuantificada indirectamente midiendo la concentración de oxígeno disuelto presente en los fangos activos. Así los cambios producidos en la respiración bacteriana, debidos a la contaminación, están relacionados con cambios 56 Introducción en la presión en el cabezal superior del equipo. La respuesta se obtiene muy rápidamente, a los 5 minutos. También Farré, M. y col., 2003, utilizaron un biosensor, el CellSense para estudiar la toxicidad de contaminantes orgánicos en aguas residuales. En su caso utilizaron células inmovilizadas de Escherichia coli sobre un electrodo que contiene un aceptor de electrones, en concreto el ferricianuro, capaz de captar electrones desde la cadena respiratoria de E. coli y transferirlos a un detector. La señal eléctrica resultante, obtenida al cabo de unos 30 minutos, nos indicará la variación en la respiración bacteriana. Existen otros ensayos para evaluar la toxicidad basados en ensayos respirométricos sobre fangos activos que combinan esta metodología con otros parámetros de medida, como espectrofotometría visible, variación de parámetros globales como COT y DBO, valoración ácido-base, etc. Por ejemplo, Freitas dos Santos, L.F. y col., 2002, combinan la medida de la respiración de fangos activos con la decoloración de un colorante (violeta tetraazolio) aunque el tiempo de respuesta es excesivamente largo (alrededor de 24 horas). Archibald, F. y col., 2001, han desarrollado una batería de cuatro ensayos para informar sobre la toxicidad de contaminantes midiendo la respiración de fangos. Tres de ellos se basa en la medida de la tasa de respiración específica del fango midiendo la DBO eliminada en la actividad bacteriana, comparándola con la actividad de la biomasa, medida en el cuarto ensayo por medida del contenido en Adenosin Fosfato (ATP) del fango. El tiempo de respuesta es demasiado largo, aproximadamente 10 días. También Pernetti, M. y col., 2003, realizaron ensayos de inhibición de la respiración en fangos activos midiendo la tasa de respiración y el carbono orgánico total (COT). Encontraron que las medidas obtenidas en los ensayos respirométricos estaban directamente relacionadas con el descenso del COT que se produce en la actividad bacteriana, con un tiempo de respuesta relativamente corto, entre 1-3 horas. Por último, es interesante destacar que Gernaey, A.K. y col., 2001, combinaron el uso de la respirometría de fangos activos con una técnica química, la valoración ácido- base, para monitorizar la evolución de la toxicidad en fangos activos. La producción o consumo de protones debido a la actividad biológica del fango puede medirse por valoración química y relacionarla con la inhibición de la respiración de los fangos. Estudio de la evolución de la toxicidad y biodegradabilidad de contaminantes persistentes en medios acuosos durante un proceso de fotocatálisis solar empleando diferentes técnicas analíticas 57 1.4.2. ESTADO ACTUAL DE LOS MÉTODOS DE ANÁLISIS DE BIODEGRADABILIDAD DE SUSTANCIAS QUÍMICAS EN AGUAS RESIDUALES La biodegradabilidad ha sido definida como la capacidad intrínseca de una sustancia a ser transformada en una estructura química más simple por vía microbiana (Ottenbrite, R.M. y col., 1992). Mediante el proceso conocido como biodegradación, los microorganismos transforman los compuestos orgánicos, la mayoría de las veces en productos menos tóxicos que los compuestos originales. La biodegradabilidad es un parámetro determinante en el comportamiento ambiental de las sustancias químicas y una propiedad deseable de los productos que se liberan en grandes cantidades al medio natural. La biodegradación puede ser “primaria” y conducir a simples alteraciones estructurales del compuesto, o bien implicar su conversión a productos inorgánicos de bajo peso molecular y constituyentes celulares, en cuyo caso se denomina “biodegradación última” o “mineralización” (OCDE, 1992) como se puede observar en la Ecuación 1.10. Compuesto orgánico + O2 ⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ →⎯ ismosmicroorgan CO2 + H2O + sales + biomasa (Ecuación 1.10) Para su evaluación se han diseñado una serie de pruebas, las cuales buscan cuantificar el grado de persistencia de estructuras químicas en ambientes naturales o industriales. Algunas de estas pruebas han sido normalizadas para garantizar que sus resultados son confiables y válidos independientemente del laboratorio en el que sean obtenidos. A continuación se hace una revisión de los métodos para la evaluación de la biodegradabilidad que han sido normalizados o que están en proceso de normalización por parte de la Organización para la Cooperación y el Desarrollo Económico (OCDE). Éstas son las pruebas de biodegradabilidad más utilizadas a nivel internacional y de ellas se deriva la mayoría de los métodos estandarizados por la Organización Internacional de Normalización (ISO), por la Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos (US-EPA) y por la Oficina Europea de Sustancias Químicas (ECB). Así mismo, se presenta la estrategia de evaluación de la biodegradabilidad más comúnmente utilizada, las principales ventajas y limitaciones de las pruebas, así como algunas tendencias de investigación futura. En el esquema establecido por el Programa de Evaluación de Productos Químicos de la OCDE, la biodegradabilidad de una sustancia se determina utilizando tres niveles sucesivos de ensayo: las pruebas de biodegradabilidad inmediata, de 60 Introducción El principio general de estas pruebas es la incubación aerobia estática, o por lote, de una cantidad reducida de biomasa en un medio mineral, a pH neutro y a una temperatura entre 20 y 25ºC. La sustancia en estudio se añade a una concentración definida, como única fuente de carbono y energía. El inóculo consiste en una población microbiana natural que no haya sido expuesta al compuesto de prueba. Estas pruebas pueden aplicarse a una gran variedad de compuestos, debido a que se basan en el seguimiento de parámetros directos y no específicos a la molécula que se estudia, como el Carbono Orgánico Disuelto (COD), o bien de parámetros indirectos correlacionados con la mineralización de la molécula, como la Demanda Bioquímica de Oxígeno (DBO) o la producción de CO2. Simultáneamente a la prueba se utilizan varios testigos, que aseguran que los resultados no se deben a una degradación abiótica, a la eliminación física de la molécula por adsorción, a la toxicidad de la sustancia o a una actividad deficiente del inóculo; ésta última se evalúa con moléculas de referencia fácilmente biodegradables, tales como la anilina o el acetato de sodio. Los resultados de los ensayos respirométricos se corrigen con la respiración endógena del inóculo, la cual se mide en ausencia de la sustancia de prueba. El nivel límite de biodegradación exigido por estas pruebas es una disminución del 70% cuando se mide el COD, y del 60% de la Demanda Teórica de O2 (ThO2) o de la Producción Teórica de CO2 (ThCO2) cuando se trata de pruebas respirométricas, valores que deben alcanzarse en un período de 28 días. ThO2 y ThCO2 se calculan a partir de la estructura química de la molécula considerando una biodegradación total de la misma (OCDE, 1992). Para un resultado positivo, y a excepción de la prueba MITI I (OCDE 301 C), los niveles límite de biodegradación deben además alcanzarse en los diez días que se suceden al final de la fase de latencia, la cual se define arbitrariamente como el tiempo necesario para alcanzar una biodegradación del 10%. A este criterio se le conoce como “la ventana de los 10 días”. El nivel máximo de biodegradación presentado al cabo de 28 días, la duración de la fase de latencia (tL) y el tiempo de vida media (t1/2), definido como el tiempo transcurrido para obtener una biodegradación del 50%, se informan como resultado de las pruebas. La obtención de estos parámetros está representada en la Figura 1.8. Estudio de la evolución de la toxicidad y biodegradabilidad de contaminantes persistentes en medios acuosos durante un proceso de fotocatálisis solar empleando diferentes técnicas analíticas 61 Figura 1.8. Representación esquemática de un proceso de biodegradación. COD: carbono orgánico disuelto; t1 tiempo de latencia; t1/2 tiempo de vida media La selección de una prueba se lleva a cabo considerando las propiedades fisicoquímicas de la sustancia. Los compuestos volátiles deben evaluarse en sistemas cerrados y preferiblemente mediante la concentración de O2 disuelto (por ejemplo la prueba OCDE 301 D). La biodegradación de los compuestos poco solubles en agua no deberá cuantificarse mediante el consumo de COD (evitar las pruebas OCDE 301 A y OCDE 301 E), mientras que deberán preferirse los ensayos respirométricos para los compuestos adsorbibles. Sin embargo, la sola elección de un método puede afectar el resultado de la prueba. Por la reducida concentración de biomasa que estipulan, las pruebas OCDE 301 D y OCDE 301 E proporcionan más resultados negativos, ya que frecuentemente necesitan largos períodos para que los microorganismos puedan reproducirse suficientemente. Por otra parte, dado que un resultado positivo en alguna de estas pruebas “restrictivas” garantiza que el compuesto se biodegradará rápidamente, son las más indicadas para los compuestos que se encontrarán en grandes cantidades en el medio ambiente. Se ha comprobado que la cinética de biodegradación de un compuesto determinado depende de la prueba que se seleccione. Reuschenbach, P. y col. (2003) encontraron que la anilina se biodegrada más rápidamente en la prueba OCDE 301 A, basada en 62 Introducción el seguimiento del COD, que en la prueba OCDE 301 F y más aún que en la OCDE 301 B, basadas en el consumo de O2 y en la producción de CO2, respectivamente. La prueba OCDE 301 B mide el CO2 producido, el cual es capturado por un álcali en un dispositivo externo al recipiente en el que se lleva a cabo la biodegradación. Si éste no cuenta con aireación y agitación suficientes, se producirá una acumulación de HCO3- que modificará la cinética de biodegradación. Además, el método de cuantificación del CO2 capturado es impreciso por si mismo, ya que éste se calcula a partir de la diferencia entre los valores de titulación del álcali del recipiente de prueba y del testigo, que son relativamente elevados. En virtud de que la prueba OCDE 301 B no es muy confiable desde el punto de vista cinético, es recomendable que el criterio de “la ventana de los 10 días” se elimine cuando se utiliza dicho método. De hecho, se ha mostrado que en el caso de tensioactivos este criterio produce falsos resultados negativos (Richterich, K. y Steber, J., 2001), aun cuando se utilicen otras pruebas de biodegradabilidad inmediata. La prueba OCDE 310 fue propuesta para solventar algunas de las limitaciones de la prueba 301 B. Esta prueba, que permite probar compuestos volátiles, poco solubles en agua y adsorbibles, se lleva a cabo en recipientes cerrados, en los que se deja un volumen determinado de aire. Durante y al final de la incubación, se sacrifican botellas de réplica para determinar el carbono inorgánico presente en el aire o en el líquido después de añadir un ácido o una base, respectivamente. Considerando la relación de volúmenes de líquido y de aire, es posible determinar la totalidad de CO2 producido. Mediante un ensayo interlaboratorio se mostró que esta prueba es la más adecuada para la determinación de la biodegradabilidad inmediata de surfactantes (Painter, H. A. y col., 2003). Pruebas de biodegradabilidad intrínseca Las pruebas de biodegradabilidad intrínseca se desarrollan bajo condiciones ambientales más favorables a la biodegradación, sobre todo en lo que concierne a la duración del ensayo y al mantenimiento de una viabilidad elevada del inóculo. Lo anterior se logra mediante la adaptación previa del inóculo a la sustancia y la adición de una fuente adicional de carbono. A la fecha, la OCDE ha normalizado tres pruebas de biodegradabilidad intrínseca en medio aerobio: los ensayos SCAS (Semi- Continuous Activated Sludge), Zahn-Wellens y MITI II, descritos en las líneas directrices OCDE 302 A, B y C, respectivamente (Tabla 1.8). Estudio de la evolución de la toxicidad y biodegradabilidad de contaminantes persistentes en medios acuosos durante un proceso de fotocatálisis solar empleando diferentes técnicas analíticas 65 cual puede ser o no marcada radiactivamente, a muestras de suelo y su posterior incubación en un biómetro a temperatura y humedad constantes y en ausencia de luz. A diferentes períodos de incubación se realiza una extracción de las muestras y se determinan los contenidos de la sustancia de prueba y de los principales productos de degradación. Los productos volátiles deben ser colectados absorbiéndolos en los medios apropiados para su posterior cuantificación. Cuando se usa la sustancia marcada con 14C es posible medir su velocidad de mineralización mediante el 14CO2 producido. Para el estudio de las rutas de biodegradación de una sustancia es suficiente realizar la evaluación con un solo tipo de suelo por un período no mayor de 120 días. Para la determinación de velocidades de biodegradación se aconseja realizar las pruebas con al menos tres tipos de suelo diferentes en su contenido de C orgánico, pH, contenido de arcilla y concentración de biomasa; estos tipos de suelo deben ser representativos del medio receptor de la molécula que se evalúa y en este caso la duración del estudio puede alargarse hasta 6 o 12 meses. Se ha encontrado que la adición de una sustancia fácilmente biodegradable estimula la degradación de la materia orgánica nativa del suelo, lo que se conoce con el nombre de imprimación (Alexander, M., 1977). El uso de sustancias marcadas al 14C permite eliminar este error, al evaluar únicamente el CO2 producto de la degradación de la sustancia. En virtud de las particularidades del medio marino, sobre todo en lo que respecta a las características de las bacterias responsables de los procesos de biodegradación, la OCDE propone una prueba de simulación de este compartimiento ambiental (OCDE 306). Esta prueba estática usa agua marina como medio e inóculo a la vez, y existe en dos variantes: el ensayo en matraz agitado que mide el consumo de COD durante 60 días, y la prueba de DBO en botella cerrada, con una duración de 28 días. Dado que se utiliza el compuesto de prueba como única fuente de carbono y de energía, así como una cantidad muy reducida de biomasa, frecuentemente se considera este método como una prueba de biodegradabilidad inmediata (Nyholm, N.,1991). Los sedimentos naturales son el receptáculo final de un gran número de sustancias químicas descargadas al medio acuático, principalmente de aquellas que por su hidrofobicidad se adsorben a la materia particulada. La prueba OCDE 309, diseñada para evaluar la biodegradabilidad aerobia de compuestos a bajas concentraciones 66 Introducción (<100 µg/L) en aguas superficiales, es un ensayo en matraz agitado que contempla la adición de sedimento (1 g/L) para simular la interfase sedimento/agua. La biodegradación se mide mediante el seguimiento de la molécula de prueba marcada con 14C o del 14CO2 producido, o utilizando técnicas analíticas lo suficientemente sensibles, durante un máximo de 60 días. En función del medio que se pretenda estudiar, el sedimento puede caracterizarse por un elevado contenido en carbono orgánico (2,5-7,5%) y una textura fina (contenido de arcillas >50%), o bien por un contenido en C orgánico reducido (0,5-2,5%) y una textura gruesa (contenido de arcillas <50%). En un ensayo más complejo (OCDE 308), la OCDE propone la simulación de las diferentes condiciones que pueden prevalecer en un sistema sedimentario. En una de sus dos variantes, la prueba simula una columna de agua aerobia con una capa subyacente de sedimento sujeta a un gradiente de O2. En la otra variante, se simula un sistema agua-sedimento completamente anaerobio. Esta prueba permite, si se utiliza la molécula marcada con 14C, la identificación y cuantificación de los productos de transformación, así como su distribución en las fases sólida y líquida. Los sedimentos deben caracterizarse en función del pH, contenido en carbono orgánico, potencial redox y concentración de biomasa. En estudios anteriores (OCDE, 1981) se ha encontrado que algunos ambientes anaerobios (por ejemplo en sedimentos) están sujetos a concentraciones de contaminantes mayores que los ambientes aerobios. Además se ha evidenciado que los microorganismos anaerobios son metabólicamente más versátiles de lo que se creía (Caldwell, M.F. y col., 1998; Anderson, R.T. y Lovley, R.D., 2000), lo cual ha incentivado el estudio y la aplicación de sistemas anaerobios para el tratamiento y la evaluación de la biodegradabilidad de una gran variedad de contaminantes. Para tal efecto la OCDE propuso el método OCDE 311. El método consiste en incubar en recipientes herméticos, durante 60 días a 35 ± 2ºC, lodos provenientes de un digestor anaerobio (1-3gSST/L; SST: sólidos suspendidos totales) en presencia de una concentración de 20 a 100 mgC/L de la sustancia de prueba. La cuantificación de la presión ejercida por los gases producto de la biodegradación anaerobia (como el CO2 y CH4) permite calcular el grado y la velocidad de degradación de la sustancia. Como control se emplean sustancias de referencia fácilmente biodegradables, tales como fenol o benzoato de sodio. Estudio de la evolución de la toxicidad y biodegradabilidad de contaminantes persistentes en medios acuosos durante un proceso de fotocatálisis solar empleando diferentes técnicas analíticas 67 Cuando se desconoce si la sustancia es tóxica para los microorganismos anaerobios, se recomienda un control adicional en el que se adicionan la sustancia de prueba y la de referencia en la misma concentración; así mismo, cuando se trabaja con una sustancia poco soluble y se emplea un disolvente, debe incluirse un control en el que se adicionan el disolvente, el medio de cultivo y el inóculo. Este método también considera el empleo de un inóculo preadaptado a la sustancia de estudio, cuando se sospecha que ésta no es fácilmente biodegradable. El método OCDE 311 está limitado a la evaluación de un sistema metanogénico; sin embargo los microorganismos anaerobios pueden utilizar una variedad de aceptores finales de electrones (por ejemplo nitratos, sulfatos, Mn y Fe), los cuales están presentes en ambientes naturales y en aguas residuales industriales. Además, no puede asumirse que el potencial metabólico en un ambiente anaerobio es el mismo con los diferentes aceptores finales de electrones (Strevett, K. y col., 2002). Por ejemplo, Hee-Sung, B. y col. (2002), al estudiar la biodegradación de pirrolidina y piperidina en ambientes desnitrificantes, sulfatorreductores y metanogénicos, observaron una degradación completa en el ambiente desnitrificante y ninguna degradación en los otros dos ambientes después de seis meses. Otra limitante del método OCDE 311 es en relación al medio de cultivo, el cual carece de compuestos orgánicos (por ejemplo vitaminas y aminoácidos), los cuales pueden ser requeridos por los microorganismos anaerobios para su óptimo crecimiento (Colleran, E. y Pender, S., 2002). Sin duda, el inóculo es el factor que más afecta la reproducibilidad de las pruebas de biodegradabilidad, especialmente en el caso de las pruebas inmediatas. Estas pruebas sólo hacen tres especificaciones respecto al inóculo: (OCDE, 1993). • debe ser de origen natural, • su densidad no debe ser mayor a 30mgSST/L • no debe tener contacto previo con el compuesto de prueba. Lo anterior permite la inoculación con aguas superficiales, lodos activados, aguas residuales domésticas, lixiviados de suelo e incluso con una mezcla de éstos (Tabla II), con la única reserva de que los lodos activados se aconsejan para las pruebas con concentraciones de biomasa elevadas (OCDE 301 A, B y F), y las aguas residuales para las pruebas a baja densidad microbiana (OCDE 301 D y E). Por otra parte, el nivel de inoculación se especifica únicamente en términos de relación volumétrica, mientras que no se exige una verificación de la masa celular introducida al ensayo. Tal 2.- OBJETIVOS 3.- PLANIFICACIÓN DE LA INVESTIGACIÓN Estudio de la evolución de la toxicidad y biodegradabilidad de contaminantes persistentes en medios acuosos durante un proceso de fotocatálisis solar empleando diferentes técnicas analíticas 77 .- Inhibición de la Bioluminiscencia .- Inhibición de la OUR de fangos activos .- Inhibición de la DBO5 ¿Eliminación = Detoxificación? .- PLAGUICIDAS .- ÁCIDO FERÚLICO .- CIANUROS ¿Eliminación = Biodegradabilidad? .- Test de Zahn-Wellens .- DBOst .- Relación DBO5 / DQO Desarrollo de sistemas acoplados de oxidación (fotocatálisis solar y oxidación biológica) Antecedentes: Tesis Métodos de oxidación avanzada para el tratamiento de las aguas residuales de la industria aceitunera. Utilización de otros métodos de tratamientos de contaminantes peristentes: Fotocatálisis solar con TiO2 y fotoFenton y otros sensibiliazadores Antecedentes: Tesis Procesos de oxidación avanzada para el tratamiento y reutilización de aguas residuales de la industria papelera. Futuras líneas de investigación abiertas PRETRATAMIENTO SENSIBILIDAD INFORMACIÓN APLICACIÓN Utilización de fangos específicos para estudiar la toxicidad de los compuestos persistentes Estudio de posibles interferencias en los tratamientos fotocatalíticos 3.- PLANIFICACIÓN DE LA INVESTIGACIÓN Estudio de la evolución de la toxicidad y biodegradabilidad de contaminantes persistentes en medios acuosos durante un proceso de fotocatálisis solar empleando diferentes técnicas analíticas 81 4.- METODOLOGÍA EXPERIMENTAL 4.1.- REACTIVOS Se han utilizado tres tipos de contaminantes en disolución acuosa para comprobar la eficacia de los tratamientos de oxidación avanzada (en concreto la fotocatálisis solar con TiO2 y los procesos fotoFenton) y poder comparar los diferentes métodos de análisis de la toxicidad y la biodegradabilidad: • Plaguicidas, comerciales y sus principios activos • Aguas residuales de la industria de recubrimientos metálicos • Compuestos fenólicos, como el ácido ferúlico Plaguicidas Se han utilizado varios tipos de plaguicidas organofosforados como el dimetoato, metidation o el metil-oxidementon y otros del tipo de los carbamatos como el carbaril. En la Tabla 4.1 aparece resumido, el nombre del plaguicida comercial, el del principio activo que contiene, en qué porcentaje está presente este principio activo en el plaguicida comercial, y la procedencia: PRODUCTO COMERCIAL PRINCIPIO ACTIVO ESTRUCTURA QUÍMICA RIQUEZA PROCEDENCIA SEVNOL CARBARIL C O O N CH3 H 85% (p/p) MAFA ULTRACID® METIDATION N N S O O CH3 CH2 S P O S O CH3 CH3 40% (v/v) SYNGENTA LAITION DIMETOATO O P S N H CH3 O S O CH3 CH3 40% (v/v) LAINCO S.A. METASYSTOX METIL- OXIDEMETON S S O P O-Me O O-Me 25% (p/v) BAYER Tabla 4.1. Plaguicidas utilizados 82 Metodología Experimental Efluentes de aguas residuales industriales de recubrimientos metálicos Los efluentes de aguas residuales obtenidos de una industria de recubrimientos metálicos, presentan como características específicas un elevado contenido en cianuros, junto con elevados contenidos de metales como cobre, niquel, zinc, etc. En general presentan fuerte coloración, un valor de pH alto y con un contenido bajo de materia orgánica (menos de 30 mg COD/L). Las aguas fueron obtenidas de una empresa de la zona, sus características son: un contenido en CN- entre 500-800 mg/L, CN- libre entre 100-150 mg/L, entre 150-250 mg/L de Cu2+, trazas de otros metales (como Zn2+, Ni2+), un pH entre 10,5-11 y una conductividad elevada con valores entre 2,2-2,5 mS/cm. Compuestos Fenólicos (Ácido Ferúlico) El ácido ferúlico (ácido 3–hidroxi-4-metoxicinámico, ver Figura 4.1) es un compuesto fenólico, comúnmente encontrado en las aguas residuales de la industria agroalimentaria (por ejemplo en alpechines). Se ha obtenido de Aldrich (isómero trans con un 99% pureza). COOH OH O-CH3 Figura 4.1. Estructura Química del Ácido Ferúlico Fotocatalizador (Dióxido de Titanio y Acridine Yellow G) El dióxido de titanio utilizado como fotocatalizador es el Aeroxide® TiO2 P-25 (CAS nº 13463/67/7), obtenido de la empresa Degussa, con las siguientes características: • superficie especifica (BET) 50±15 m2/g • densidad aparente 130 g/L • porcentaje de humedad < 1.5% • pH (4% en agua) 3.5-4.5 Estudio de la evolución de la toxicidad y biodegradabilidad de contaminantes persistentes en medios acuosos durante un proceso de fotocatálisis solar empleando diferentes técnicas analíticas 85 sódico. Se utilizaron preferentemente entre 24-48 horas después de su recogida. Presentaban un valor de sólidos sedimentados totales de entre 2-4 g/L. Bacterias Luminiscentes Las cepas de bacterias luminiscentes utilizadas en el ensayo de inhibición de luminiscencia, para determinar la toxicidad de las muestras, pertenecen a la especie marina Vibrio fischeri NRRL B-11177, suministradas por Macherey-Nagel GMBH & Co. KG. Se encuentran en forma de reactivos comerciales liofilizados, siendo conservadas en un congelador entre -18ºC y -20ºC. Vibrio fischeri ha sido clasificada, según la hoja informativa B006 1/92 ZH 1/346 de la Asociación profesional de la industria química, en el grupo de riesgo 1, es decir que no supone ningún riesgo para las personas y para los animales vertebrados. Gases El oxígeno utilizado para la combustión en el ensayo de determinación del carbono orgánico disuelto (COD), suministrado por Praxair, presenta una pureza del 99% y contiene menos de 1 mg/L de CO2, CO e HC y previamente humedecido. Agua Ultrapura El agua ultrapura (grado Mili Q) utilizada para todas las disoluciones necesarias para las determinaciones analíticas, fue obtenida de un equipo Millipore Elix 3510, y sus principales características son: • COT menor de 30 µg/L • Resistividad de entre 10-15 MΩ·cm Filtros de membrana de polipropileno Las muestras tratadas son filtradas para su posterior análisis según los diferentes métodos analíticos utilizados. Los filtros que se utilizan son proporcionados por WTW y son filtros de membrana de propileno, con un tamaño de poro de 0,45 µm y un diámetro de 25 mm. 4.2.- EQUIPOS DE ANÁLISIS Los equipos de análisis utilizados en todo este trabajo se encuentran ubicados en los laboratorios que el Departamento de Ingeniería Textil y Papelera tiene en la Escuela 86 Metodología Experimental Politécnica Superior de Alcoy, tanto en los laboratorios docentes de química general e instrumental, como en el laboratorio de investigación del grupo de oxidación avanzada. Balanza Analítica La balanza electrónica (Figura 4.3), de tipo analítico, empleada para la medida de todas las sustancias sólidas utilizadas en este trabajo, han sido de la marca comercial SARTORIUS, con un rango de medida de hasta 200 g y una sensibilidad de 0,1 mg. Figura 4.3. Balanza Analítica Estufa La estufa (Figura 4.4) utilizada para la caracterización de los fangos, midiendo los sólidos en suspensión totales (SST) según Standard Methods 2540-D, ha sido de la marca BINDER modelo ED23. Es una estufa de circulación de aire natural, con posibilidad de rampa de temperatura, con una Tª máxima de 300±0,1ºC. Figura 4.4. Estufa para determinación de SST Estudio de la evolución de la toxicidad y biodegradabilidad de contaminantes persistentes en medios acuosos durante un proceso de fotocatálisis solar empleando diferentes técnicas analíticas 87 Bomba de vacío La bomba de vacío empleada en la medida de los sólidos en suspensión totales de fangos activos ha sido de la marca DINKO, modelo D-95, con una rampa de vacío de WTW con placa de filtro de 90 mm de diámetro (Figura 4.5). Los filtros utilizados se describieron en el apartado anterior, y las medidas de peso se realizaron, después de dejar reposar los filtros en un desecador hasta alcanzar un peso constante, con la balanza analítica arriba descrita. Figura 4.5 Trampa de vacío para determinación de SST La norma estandarizada empleada ha sido Standard Methods 2540-D. pHmetro El equipo empleado ha sido un pHmetro CRISON modelo micropH 2002 (Figura 4.6), como el de la figura, con electrodos de pH de vidrio, electrodo de referencia y compensador de temperatura: Figura 4.6. pHmetro La norma estandarizada empleada ha sido Standard Methods 4500-H. 90 Metodología Experimental Analizador de Carbono Orgánico Total (COT) Los análisis se realizaron en un equipo Shimadzu modelo TOC-VCSH (Figura 4.10) que permite cuantificar la materia orgánica presente en una muestra líquida o sólida. Consta de una válvula de inyección automática, un horno que puede calentar hasta 950ºC, un catalizador de platino sobre un soporte de alúmina, una trampa (scrubber) para halógenos y un deshumidificador, un recipiente para ácido fosfórico (necesario para acidificar la muestra y medir el carbono inorgánico, CI), entrada y salida del gas para la combustión catalítica, oxígeno, y un detector de infrarrojo no dispersivo (NDIR) conectado a un registrador y analizador automático. Figura 4.10. Analizador de Carbono Orgánico Total (COT) El analizador de carbono contiene un generador de ozono (y un equipo térmico de destrucción del ozono), para poder medir la cantidad de nitrógeno total, por la reacción del ozono con los compuestos nitrogenados, y posterior quimioluminiscencia que se detecta en el IR con un pico a 1200 nm. Respirómetro Para realizar las medidas de respiración de los fangos activos se utilizó Respirómetro NEURTEK Medio Ambiente S.A., modelo BM3-LAB (Figura 4.12). El modo de trabajo fue en automático y en discontinuo en circuito hidráulico cerrado. Ello significa que el fluido circula de forma repetitiva sobre un mismo circuito, que consta de: • depósito aireado (ida) • celda de flujo con sensor de oxígeno disuelto • cámara de reacción no aireada Estudio de la evolución de la toxicidad y biodegradabilidad de contaminantes persistentes en medios acuosos durante un proceso de fotocatálisis solar empleando diferentes técnicas analíticas 91 • sistema de conmutación • depósito aireado (vuelta) Después de que las muestras pasen por cada uno de los ciclos y por un mismo sistema de análisis, se llevan a cabo las medidas que darán lugar a los correspondientes cálculos o determinaciones. Un esquema de este ciclo está representado en la Figura 4.11. Figura 4.11. Esquema de funcionamiento del respirómetro (cortesía de NeurteK Medio Ambiente S.A.) El funcionamiento del respirómetro está basado en la medida automática y continua de la tasa de respiración de los fangos activos (mgO2/L·h). Para ello se llevan a cabo de forma secuencial las medidas de oxígeno disuelto (ISO 5814, 1990) a la entrada de la cámara de reacción (OD1) y oxígeno disuelto a la salida de la cámara de reacción (OD2). El oxímetro utilizado es de tipo polarográfico, con un electrodo de membrana donde el elemento sensor está protegido por una membrana plástica de polietileno y fluorocarbono. La corriente difusora es linealmente proporcional a la concentración de oxígeno; esta corriente se transforma linealmente en unidades de concentración, por medio de varios procedimientos de calibración. Un cátodo inerte de oro como soporte, facilita la reducción del oxígeno disuelto de la muestra, mientras el ánodo de plomo se utiliza como fuente de electrones, puesto en contacto todo ello con una disolución fuertemente alcalina de KOH. El oxímetro tiene un método de compensación automática de la Tª y de la salinidad. 92 Metodología Experimental Figura 4.12. Respirómetro de laboratorio BM3-LAB Analizador de la Demanda Bioquímica de Oxígeno (DBO) Para medir la Demanda Bioquímica de Oxígeno (DBO) utilizamos unos recipientes de incubación de vidrio borosilicatado opacos (botellas para la DBO). Las botellas tienen hasta 500 mL de capacidad, cerradas en la parte superior de forma hermética. En este caso para medir la presión del interior se utilizó OXITOP® (Figura 4.13). Figura 4.13. Equipo para la determinación de la Demanda Bioquímica de Oxígeno Las botellas de DBO de la marca WTW, están calibradas y en ellas se puede colocar, en la parte superior, un recipiente de plástico con una trampa alcalina (NaOH o KOH sólidos) que permite que se produzca la depresión en el interior de la botella debido al Estudio de la evolución de la toxicidad y biodegradabilidad de contaminantes persistentes en medios acuosos durante un proceso de fotocatálisis solar empleando diferentes técnicas analíticas 95 El equipo puede efectuar una serie de ensayos de toxicidad, mutageneidad e incluso ensayos de biología molecular y bioquímicos, gracias al software integrado que presenta. Los resultados se pueden mostrar opcionalmente en forma de % de inhibición, % de estimulación o unidades relativas de luz (RLU, siglas debido a la forma en inglés, relative Light units). Las cubetas de medida pueden ser de 50x12 mm o también de 75x15 mm. Las que nosotros utilizamos en nuestros ensayos son las de 50x12 mm. 4.3.- PLANTAS PILOTO DE TRATAMIENTO Para este trabajo se han utilizado tres plantas piloto para realizar la fotocatálisis solar y los procesos de fotoFenton: • dos de ellas situadas en la azotea de la Escuela Politécnica Superior de Alcoy, se han utilizado para la eliminación de los plaguicidas y el ácido ferúlico • la otra situada en una empresa de recubrimientos metálicos, en el término municipal de Ibi (Alicante), se ha utilizado para la eliminación de cianuros de sus aguas residuales. Planta piloto de fotocatálisis solar de 4L La planta solar de 4L SOLARDETOX® ACADUS-2005/0.25 (Figura 4.17) es una pequeña planta de fotocatálisis, realizada totalmente en aluminio anodinado, lo que asegura una gran resistencia a la corrosión. Tiene acoplado un radiómetro ACADUS 85, que consta de un sensor ultravioleta de teflón, de tipo fotométrico (fotodiodos tipo Ga-As-P, de difusión, con filtro incorporado, rango de respuesta entre 300-400 nm con un pico de medición a 370 nm). La radiación solar se mide en unidades de potencia/superficie (W/m2) y se integra automáticamente por el LS-3300 para indicar la energía recibida (W·h/m2), en el rango ultravioleta cercano. La planta solar de 4L presenta una bomba centrífuga impulsora PanWorld 5PX-Z de propileno reforzado con fibra de vidrio con rotor cerrado y de escasa potencia (11W), que requiere un volumen mínimo de 3,5L para evitar problemas de burbujas de aire. Tiene 4 tubos de borosilicato, de 750 mm de longitud y 32 mm de diámetro, con un volumen de 2L cada tubo, siendo el volumen irradiado de 1,8L. Los tubos están sobre una superficie de espejos de aluminio tipo CPC de 1 (un) sol de concentración y presentan una inclinación de 30º. La superficie útil irradiada es de 0,257 m2 y el rango de volumen de trabajo varía entre 3,5-4,3 L siendo la temperatura máxima de trabajo de 55ºC. 96 Metodología Experimental Figura 4.17. Planta piloto de fotocatálisis solar de 4L. Planta piloto de fotocatálisis solar de 24L La planta solar de 24L es una SOLARDETOX® ACADUS-2001 (Figura 4.18), proporcionada por Ecosystem, es una planta solar de fotocatálisis que presenta características similares a la anterior. El radiómetro utilizado para medir la intensidad solar es idéntico a la de planta de 4 L, pero la bomba es un poco diferente, ya que es una bomba centrífuga impulsora PanWorld 100PX-X de propileno reforzado con fibra de vidrio y arrastre magnético y de mayor potencia que la anterior (140 W), que requiere un volumen mínimo de 22L para evitar problemas de burbujas de aire. Tiene 16 tubos de borosilicato, de 1500 mm de longitud y 32 mm de diámetro, con un volumen de 16L cada tubo, siendo el volumen irradiado de 15,1L. Los tubos están sobre una serie de espejos de aluminio tipo CPC de 1 (un) sol de concentración y presentan una inclinación de 30º. La superficie útil irradiada es de 2,15 m2 y el rango de volumen de trabajo varía entre 22-32L. Figura 4.18. Planta piloto de fotocatálisis solar de 24L Estudio de la evolución de la toxicidad y biodegradabilidad de contaminantes persistentes en medios acuosos durante un proceso de fotocatálisis solar empleando diferentes técnicas analíticas 97 Planta piloto de fotocatálisis solar de 50L La planta solar de 50L es una SOLARDETOX® ACADUS-2006 (Figura 4.19), también fabricada por Ecosystem, es una planta solar de fotocatálisis con características similares a las de la planta de 24L, ya que está formada por dos mitades de 24L acopladas. Tiene el mismo radiómetro para medir la intensidad solar y la misma bomba. En este caso requiere un volumen mínimo de 40L para evitar problemas de burbujas de aire. Tiene 24 tubos de borosilicato, de 1500 mm de longitud y 32 mm de diámetro, con un volumen de 16L cada tubo, siendo el volumen irradiado de 15,1L. Los tubos están cubiertos con espejos de aluminio tipo CPC de 1 (un) sol de concentración y presentan una inclinación de 45º. La superficie útil irradiada es de 3 m2 y el rango de volumen de trabajo varía entre 40-50L. Figura 4.19 Planta piloto de fotocatálisis solar de 50L 4.4.- MÉTODOS DE ANÁLISIS DE LA TOXICIDAD 4.4.1. DETERMINACION DE LA INHIBICIÓN DE LA LUMINISCENCIA DE Vibrio fischeri Basado en la norma ISO 11348-3, 1998. Hay que destacar que se dictó esta tercera sección de la norma debido a la diferente sensibilidad que demuestran los ensayos con Vibrio fischeri según sea su procedencia. Está dedicada al estudio de éste método de análisis de toxicidad utilizando bacterias liofilizadas, para diferenciar la metodología con bacterias deshidratadas (ISO 11348-2 1998) y con bacterias de preparación reciente (ISO 11348-1, 1998).