Revisão - ensaio, Notas de estudo de Biologia

Baixe Revisão - ensaio e outras Notas de estudo em PDF para Biologia, somente na Docsity! a Ro poa BM: Biociências 4 , ) o ' EN DA A ec Sd N A II Workshop da Pós-Graduação 23 a 25 de abril de 2009 - Botucatu/SP Pa  Editores: Ney Lemke Filipe Galvão Ferreira Raquel de Cássia dos Santos Carlos Alberto da Silva Ribeiro Paulo Roberto da Fonseca Fillho unesp UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULIST; “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” Comissão Científica Presidente Profa. Dra. Cláudia Helena Pellizzon Coordenador Editorial Prof. Dr. Ney Lemke Secretários de Avaliação Filipe Galvão Ferreira Paulo Roberto da Fonseca Filho Avaliadores Centro de Assistência Toxicológica – IBB/UNESP Dr. Antonio Francisco Godinho Centro Universitário Eurípides de Marília Prof. Leonardo Castro Botega Faculdade de Ciências – UNESP Prof. Dr. Aloísio Costa Sampaio Profa.Dra.Anne Ligia Dokkedal Bosqueiro Profa.Dra.Ignez Caracelli Profa.Dra.Jandira Liria Biscalquini Talamoni Prof. Dr. Jehud Bortolozzi Profa.Dra.Terezinha de Fátima Fumis Faculdade de Medicina de Botucatu – UNESP Profa.Dra.Diana Rodrigues Pina Miranda Instituto de Biociências de Botucatu – UNESP Profa. Dra. Adriane Pinto Wasko Profa. Dra. Cláudia Pio Ferreira Profª. Drª. Clélia Akiko Hiruma Lima Prof. Dr. Ivan de Godoy Maia Prof. Dr. Joel Mesa Hormaza Prof. Dr. José Ricardo de Arruda Miranda Profa. Dra. Luzia Aparecida Trinca Profa.Dra.Mirtes Costa Profa. Dra. Sandra Cordellini Profa. Dra. Wilma de Grava Kempinas Instituto de Biociências Letras e Ciências Exatas – UNESP Prof. Dr. Maurílio Boaventura Instituto de Geociências e Ciências Exatas – UNESP Prof. Dr. José Silvio Gavone Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares CNEN Profa. Dra. Maria da Penha Albuquerque Potiens Programa de Pós-graduação em Biologia Geral e Aplicada Dr. Leonardo Noboru Seito Eros Duarte O. Carbi Programa de Pós-graduação em Biometria Kátia Prado Fernandes Giovana Fumes Rosangela P. Sanches Programa de Pós-graduação em Biologia Celular e Estrutural - UNICAMP Luiz Gustavo de Almeida Chuffa MSc. Marina Trevizan Guerra Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas: Botância - UNESP MSc. Tainara Bortolucci Ferrari MSc. Letícia Silva Souto Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas: Farmacologia –UNESP Carlos Alberto da Silva Ribeiro MSc. Celso A. R. A. Costa Filipe Galvão Ferreira MSc. Hélio Kushima Letícia Diniz Vieira Luiz Ricardo Almeida Kiguti Raquel de Cássia dos Santos Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas: Genética – UNESP Carlos Alexandre Henrique Fernandes Dra. Agnes Takeda Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas: Zoologia – UNESP MSc. Guilherme A. M. Lopes Lara Wichr Genovez Ligia Ferreira Martins Programa de Pós-graduação em Ciências da Computação – ICMC/USP MSc. André R. Backes Technische Universität Dresden Rafael Gregório Mendes Unidade Diferenciada de Sorocaba – UNESP Prof. Dr. Leonardo Fernandes Fraceto Università degli Studi di Padova Mariana Cintra Francischinelli Universidade de Sorocaba Prof. Dr. Fernando de Sá Del Fiol Profa.Dra.Luciane Cruz Lopes Profa.Dra.Marcela Pellegrini Peçanha Profa.Dra.Renata Lima Profa.Dra.Yoko Oshima Franco Apoio Fundibio Instituto de Biociências de Botucatu - UNESP Programas de Pós-graudação em:  Biologia Geral e Aplicada  Biometria  Ciências Biológicas: Botânica  Ciências Biológicas: Farmacologia  Ciências Biológicas: Genética  Ciências Biológicas: Zoologia Pró-reitoria de Graduação – UNESP Pró-reitoria de Pós-graduação – UNESP Agradecimentos Prof. Dr. José Roberto Corrêa Saglietti CAPÍTULO 01 DESVENDANDO A BIODIVERSIDADE: COMO A BIOLOGIA MOLECULAR PODE CONTRIBUIR? Luiz Henrique Garcia Pereira Departamento de Morfologia – Instituto de Biociências – UNESP – Botucatu luizhgp@ibb.unesp.br Guilherme José da Costa Silva Departamento de Morfologia – Instituto de Biociências – UNESP – Botucatu costa_silva@ibb.unesp.br Resumo: O conhecimento acerca da diversidade biológica é o ponto de partida para todos os estudos básicos e/ou aplicados relacionados às ciências da vida. O grande número de espécies estimadas para o planeta (10-15 milhões, 1,8 milhão conhecidas) frente ao impedimento taxonômico que se vive na atualidade exige o desenvolvimento de novas ferramentas para o estudo da biodiversidade. Nesse contexto a biologia molecular tem contribuído sobremaneira, abrangendo desde estudos no nível individual/populacional até o estabelecimento de relações filogenéticas e na contextualização espaço- temporal. 1 - Introdução O conhecimento acerca da diversidade biológica é o ponto de partida para todos os estudos básicos ou aplicados relacionados às ciências da vida e o reconhecimento de espécies, bem como a habilidade de nomeá-las, é fundamental para o estudo da ecologia, comportamento, evolução e todas as outras disciplinas relacionadas aos organismos [1]. Apesar de muito difundido nos dias atuais, o termo diversidade biológica começou a ser utilizado na literatura somente a partir da década de 1980 por Norse e McManus [2 ] . O termo biodiversidade tem seu uso mais recente, sendo utilizado pela primeira vez em 1985, por W. G. Rosen para uma reunião do Foro Nacional sobre biodiversidade americano e t o r n o u - s e c o n h e c i d o a p a r t i r , principalmente, da publicação do livro organizado por Wilson e Peter em 1988 [3], intitulado “Biodiversity”. Os dois termos são utilizados, hoje, como sinônimos e sua definição é ampla. A convenção sobre Diversidade Biológica (CDB) realizada pela Organização das Nações Unidas (ONU) em 1992 define diversidade biológica como sendo “a variabilidade de organismos vivos de todas as origens, compreendendo, dentre outros, os ecossistemas terrestres, marinhos e outros ecossistemas aquáticos e os complexos ecológicos de que fazem parte; compreendendo ainda a diversidade dentro das espécies, entre espécies e de ecossistemas.” [4]. A diversidade dentro das espécies aqui apresentada deve ser entendida como toda a variação existente entre indivíduos de uma população e entre populações de uma mesma espécie a qual pode ser designada como diversidade genética. Assim, os termos diversidade biológica ou biodiversidade englobam todos os n íve is h ierárquicos de variabilidade, desde os genes aos ecossistemas. A diversidade biológica mundial é estimada entre 10-15 milhões de espécies, das quais aproximadamente 1,8 milhão são conhecidas e descritas formalmente [5; 6; 7]. Para o Brasil são conhecidas aproximadamente 200.000 espécies e estima-se que a biodiversidade brasileira esteja compreendida entre 1,4 e 2,4 milhões de espécies [8]. Entre 1978 e 1995 8 foram descritas 7.302 espécies para o Brasil, cerca de 430 por ano [9]. Nesse ritmo seriam necessários aproximadamente 4.000 anos para descrever as espécies estimadas somente na fauna brasileira. O fator limitante nesse contexto é a falta de especialistas para a descrição dessas espécies, principalmente para os grupos dos invertebrados, para o qual, em alguns subgrupos, não existe sequer um especialista no Brasil. Mesmo para os grupos mais bem estudados, o número de taxonomistas é insuficiente frente ao número de espécies por descobrir e descrever (ver referências [8] e [9]. Esse problema se repete em todo mundo e é c o n h e c i d o c o m o “ I m p e d i m e n t o Taxonômico”. Várias ações no mundo todo têm sido realizadas no intuito de resolver esse problema. No Brasil, o Ministério da Ciência e Tecnologia, lançou em 2005 um programa de Capacitação em Taxonomia que previa a formação de 60 novos doutores num período de sete anos. No entanto, sabe-se que a formação de especialistas nessa área é lenta e gradual e esse número, apesar de aumentar em 46% o número de taxonomistas no Brasil, é ainda insuficiente. Outro fator relevante a cerca da biodiversidade é a questão da extinção. O livro vermelho da fauna brasileira lançado em 2008 aponta 627 espécies ameaçadas de extinção. A lista da flora ameaçada, também lançado em 2008, aponta 472 espécies ameaçadas (ver site Ministério do Meio Ambiente). Esses valores são reconhecidamente subestimados, uma vez que, para muitas espécies ainda faltam informações. No mundo, são estimadas, segundo a União Internacional para a Conservação da Natureza e dos Recursos Naturais ( IUCN), 16.928 espécies ameaçadas de extinção entre animais, vegetais e fungos (dados de 2008, fonte: www.iucn.org). Vale ressaltar que os dados aqui apresentados referem-se apenas às espécies já descritas e reconhecidas. Extrapolando esses valores para toda a biodiversidade estimada para o planeta, centenas a milhares de espécies devem se extinguir por ano sem antes mesmo podermos conhecê-las. Estima-se que o planeta perca cerca de 0,25% de suas espécies por ano (cerca de 12.000 espécies) [10] e pesquisadores já questionam a possível ocorrência nos dias atuais da sexta extinção em massa do nosso planeta [11]. D i a n t e d e s s e c e n á r i o , n o v a s metodologias se fazem necessárias para auxiliar as metodologias tradicionais no estudo e conhecimento da biodiversidade. Nesse contexto, a biologia molecular tem se mostrado uma ferramenta valiosa, acelerando o processo de descoberta de novas espécies, bem como auxiliando no estudo e conservação das mesmas. 2 - Diversidade Molecular C o m o v i s t o a n t e r i o r m e n t e a biodiversidade engloba também toda variabilidade encontrada dentro das espécies e dentro das populações de uma dada espécie, ou seja, a variabilidade genética. Entende-se por variabilidade genética todo conjunto genômico de uma espécie com suas variações. O componente genético da biodiversidade é fundamental, pois é a variação genética que fornece o material básico para a seleção natural e, portanto, para a evolução de todas as espécies [12]. Essa variação compõe a matéria bruta para os estudos moleculares permit indo comparar ind iv íduos , populações ou espécies diferentes. Ela permite verificar as afinidades e os limites entre as espécies, detectar modos de reprodução e estrutura familiar, estimar níveis de migração e dispersão nas 9 populações e até mesmo ajudar na identificação de restos animais, como conteúdos estomacais e produtos industrializados de espécies ameaçadas de extinção [13]. Para isso faz-se o uso de marcadores moleculares, que são locos gênicos que apresentam a lguma variabilidade no escopo do problema a ser estudado [13; 14]. Atualmente existe uma gama de marcadores moleculares desenvolvidos e utilizados nos mais diferentes estudos envolvendo biologia molecular. Alguns deles são AFLP, RAPD, isoenzimas, DS-PCR, minissatélites, microssatélites, RFLP, seqüenciamento de DNA, dentre outros. No entanto, não é intuito desse capítulo descrever tais marcadores (para uma revisão detalhada desses marcadores moleculares ver referências [13]; [14]; [15]; [16]; [17]). Porém, é importante ressaltar que os diferentes marcadores moleculares podem possuir taxas de substituição/evolução diferentes, de modo que, através de uma escolha criteriosa desses marcadores, pode-se estudar desde problemas de identificação de indivíduos à identificação de espécies crípticas ou formulação de hipóteses filogenéticas em grupos de categoria taxonômica elevada [18]. Os critérios de escolha de alguns desses marcadores serão discutidos mais adiante nesse capítulo. A biologia molecular hoje tem figurado em todas as áreas da biologia, mas por simplificação vamos classificá-las em duas grandes subáreas para ilustração neste capítulo. Uma conhecida como Genética da Conservação, que engloba estudos ecológicos, populacionais, de estruturação familiar e social, padrões de migração e dispersão, dentre outros; e outra denominada de Sistemática Molecular, que engloba estudos que vão desde a identificação de espécies até a organização dessas em suas relações de parentesco e num contexto espaço-temporal (englobam identificação e discriminação de espécies, reconstruções filogenéticas, estudos filogeográficos e biogeográficos, dentre outros). É dentro dessa segunda subárea que nos ateremos neste capítulo, visando demonstrar como a biologia molecular pode contribuir na descoberta e caracterização da biodiversidade. 3 - Desvendando a Biodiversidade 3.1 - Identificação Molecular Há algum tempo é do conhecimento geral que a diversidade de seqüências do DNA, acessada direta ou indiretamente, através da análise de proteínas, pode ser usada para discriminar espécies. Há mais de 40 anos atrás, a eletroforese de proteínas em géis de amido foi, pela primeira vez, utilizada para identificar espécies [19]. Há aproximadamente 30 anos atrás, a análise de seqüências de genes de DNA ribossômico foi utilizada para investigar as relações evolutivas em níveis superiores [20] e as pesquisas em DNA mitocondrial dominaram a Sistemática Molecular no final da década de 70 e início da década de 80 [13]. Atualmente um número considerável de trabalhos tem sido realizado, ut i l izando-se dos mais d iversos marcadores mo lecu l a res pa ra a identificação de espécies. Há trabalhos que se utilizam de aloenzimas [21; 22], fragmentos obtidos por enzimas de restrição (RFLP) [23], DNA arrays [24], SNPs (single-nucleotide polymorphism) [25], PCR-Muiltiplex [26], sequências de DNA dos mais variados genes [27; 28] dentre outros. No entanto, apesar dessas técnicas responderem satisfatoriamente aos problemas propostos, o uso de diferentes técnicas e/ou genes por diferentes laboratórios para diferentes grupos 10 um rigoroso processo de reanálise, a fim de se evitar ambigüidades geradas por erros de seqüenciamento. Esse protocolo de v a l i d a ç ã o ( d i s p o n í v e l e m w w w . b a r c o d i n g l i f e . o r g . b r ) e s t á padronizado e tem sido seguido nos trabalhos de obtenção do DNA barcode para as diferentes espécies. Esse fato é relevante, uma vez que torna o sistema de identificação confiável. 3.2.3 - Identificando Novas Espécies Hebert et al. [32] estudando 460 amostras de borboletas da região nordeste da Costa Rica da espécie Astraptes fulgerator, descrita em 1775, mostrou que havia pelo menos dez espécies crípticas nessa região. As diferenças encontradas n a s s e q ü ê n c i a s d e D N A f o r a m correspondentes à observação de que havia diferentes padrões de coloração nas lagartas dessa espécie. A partir desse estudo, os autores propuseram um valor de corte para a delimitação entre espécies. Eles sugerem que esse valor seja, pelo menos, 10 vezes o valor da média de divergência intra-específica observada no grupo em estudo. Os fundamentos para essa proposição são simples de se deduzir. Está baseado no fato de que a divergência genética entre os grupamentos formados foi, em média, 10 vezes maior que a divergência genética observada dentro de cada grupamento [32]. Como apresentado anteriormente, espera-se que a divergência genética dentro de uma dada espécie seja baixa, uma vez que os indivíduos que a compõe compartilham da mesma história evolutiva. Outro valor relevante a ser observado é a divergência genética média que é observada entre as espécies já nominadas do gênero em estudo que podem servir de referência para a delimitação entre as espécies que o compõe. Vale ressaltar aqui, que o valor atribuído por Hebert é apenas uma sugestão, devendo cada pesquisador observar em seu trabalho os valores obtidos para se determinar o valor de corte mais apropriado de acordo com a história evolutiva do grupo em estudo, a qual pode ser recente ou muito antiga. Muitos trabalhos têm sido publicados mostrando a eficiência do método barcode na descoberta de novas espécies (ver referências [33]; [34]; [35]; [36]; [37]; [38]), muitas das quais são confirmadas pelos mé todos t r ad i c i ona i s . Ass im , a metodologia de identificação por DNA barcode pode acelerar sobremaneira a descoberta de novas espécies tornando-se uma val iosa ferramenta para os taxonomistas. 3.2.4 - Problemas e Controvérsias Como toda metodologia, o sistema de identificação por DNA barcode possui algumas limitações. São quatro, as principais limitações encontradas [29]. 1 - nos casos onde há hibridização entre espécies, o espécime analisado seria atribuído a sua espécie materna, uma vez que se utiliza um gene mitocondrial (COX I). Nesses casos a associação com marcadores nucleares é necessária para a resolução do problema. 2 - para alguns grupos a taxa de divergência do COX I é baixa, não sendo suficiente para discriminar espécies. De fato, para o Reino Vegetal, o COX I apresenta essa característica. A adoção de regiões mais variáveis no genoma das plantas se faz necessária. Alguns trabalhos ([39]; [40]) tem proposto a utilização de uma combinação de dois genes como padrão na identificação de plantas. 3 - há grupos onde suas espécies, ou parte delas, divergiram recentemente. Assim o COX I pode não ter acumulado divergência suficiente para separá-las corretamente. Nesse caso a utilização combinada com um gene que possua uma taxa evolutiva maior pode ser suficiente para discriminar essas 13 espécies. 4 - há ainda a possibilidade da existência, para algumas espécies, de pseudogenes para o COX I. Durante a amplificação do segmento de DNA barcode e s s e s p s e u d o g e n e s p o d e m s e r amplificados conjuntamente. Normalmente esses pseudogenes possuem uma taxa de mutação maior que a do gene verdadeiro. Dessa forma, as divergências genéticas encontradas podem ser superestimadas levando a separação errônea de espécimes pertencentes a uma única espécie. Nesses casos, a identificação desses pseudogenes e o desenho de primers específicos somente para o gene verdadeiro podem resolver a questão. Outra questão importante a ser esclarecida nesse capítulo é a confusão de conceitos entre Taxonomia de DNA e DNA Barcode. Paralelamente à proposição da criação do sistema de DNA barcode, foi lançada uma discussão sobre a criação de um sistema de taxonomia baseado em sequências de DNA [41; 42]. Sua proposta visa passar o DNA de uma posição auxiliar na descrição de espécies para uma posição central a fim de se acelerar o processo descritivo frente à grande diversidade estimada para o planeta e a falta de recursos humanos para esse f im. Mui tos pesquisadores em todo mundo acabaram por sinonimizar essas duas proposições e uma série de criticas foi lançada [43; 44; 45], cuja preocupação principal é a substituição do método tradicional pelos métodos moleculares. No entanto, faz-se necessário esclarecer que, embora as duas propostas se utilizem da mesma ferramenta (sequências de DNA), seus objetivos são diferentes. No texto de Hebert et al. [30] fica claro que a identificação molecular (DNA barcode) não visa substituir os métodos tradicionais num primeiro momento. No entanto, uma vez estabelecida e validada a seqüência barcode de uma determinada espécie, esta poderia ser identificada por qualquer pessoa, a partir da comparação da seqüência do exemplar que tem em mãos com as depositadas no banco de dados do barcode. Com isso, os autores propõe um acesso rápido e democrático à identificação de espécies, o que desafogaria os taxonomistas tradicionais, deixando-os com tempo para se debruçarem na descrição de novas espécies. Outra crítica que se faz ao sistema barcode é o seu uso na descoberta de novas espécies [45]. No entanto, como visto anteriormente, o uso desse sistema na identificação de novas espécies é promissor e está baseado em severos critérios de análise antes que uma suposta nova espécie se ja proposta . A inda ass im, os pesquisadores ao se depararem com tal situação sugerem a existência de uma nova espécie, sendo de senso comum, salvo raras exceções, que a confirmação ou refutação de tal sugestão seja feita por um taxonomista tradicional. O objetivo proposto por Hebert em seu trabalho é que o sistema de identificação barcode funcione como uma valiosa ferramenta na descoberta de candidatos a novas espécies, mas sem substituir a forma de descrição tradicional. As espécies, uma vez propostas, seriam encaminhadas a especialistas para sua confirmação ou refutação. Com isso, o sistema barcode funcionaria como uma ferramenta auxiliar nesse sentido, alavancando e valorizando o trabalho dos taxonomistas, uma vez que eles teriam acesso mais fácil e rápido a descoberta e proposta de novas espécies. Como visto, sistemas de identificação molecular não são novidades. O que é novo no projeto DNA barcode são a padronização do método e a criação de um banco de dados único para as sequências geradas de acesso público e democrático. O sistema barcode visa facilitar e acelerar o 14 Cladísta embasando-se na sistemática filogenética. Toda a metodologia da sistemática parte de duas necessidades, a primeira da existência de marcadores, sejam eles de origem morfológica, fisiológica, comportamental ou molecular e a segunda de que esses caracteres possuam origem embrionária comum, ou seja, os marcadores devem ser homólogos. Além desses requisitos básicos é preciso conhecer a evolução dos caracteres. Dentro de caracteres moleculares de DNA a fonte de variabilidade primária é a mu ta ção . Ou t ro s e ven tos como recombinação gênica, por exemplo, são responsáveis por difusão e rearranjos dessa variabilidade. A taxa de mutação no DNA parece ser aproximadamente constante ao longo do tempo, porém isso nem sempre é verdade. Teorias que tentam entender a taxa de evolução do DNA são abundantes, porém todas possuem limitações. Dentre essas teorias podemos destacar a evolução ao longo do tempo, onde o DNA evolui em taxas constantes, sendo a forma de evolução molecular mais simples. Outra teoria estima que a taxa de evolução do DNA deva ser medida a partir do número de gerações, isso porque as mutações herdáveis são transmitidas através da fecundação. Quanto maior o tempo da geração maior o tempo para transmitir a mutação, consequentemente menor a evolução do genoma ao longo do tempo. Essa teoria baseia-se em falhas que ocorrem apenas durante a replicação do DNA para formação dos gametas e não leva em consideração erros do mecanismo de correção. Outro modelo de evolução do genoma baseia-se em erros do mecanismo de reparo, porém também possui limitações, como por exemplo, a não consideração do tempo de geração. Outros modelos levam em consideração outros fatores como metabolismo e taxa de levantamento e o acesso a diversidade biológica e tem se mostrado eficiente e promissor. Como toda metodologia tem suas falhas e limitações, as quais deverão ser sanadas e/ou minimizadas ao longo tempo. Em nenhum momento, os pesquisadores envolvidos no projeto estão dissociados das ferramentas tradicionais e, salvo exceções, acreditam que a união dessas ferramentas (tradicionais e moleculares) será valiosa na descoberta e entendimento da biodiversidade. 4 - Organizando a Biodiversidade Para se realizar análises das mais diversas, a partir de dados moleculares, é interessante conhecer primeiro o grupo de organismos que se pretende estudar, tal como o segmento de caracteres moleculares com que se pretende trabalhar. Para isso o conhecimento biológico deve estar inserido em um grau de organização que leve em consideração a biologia, as características de diferentes origens, a distribuição espaço-temporal e a história evolutiva do grupo de organismos em questão. A parte da ciência que tenta elucidar tais questões é conhecida como s i s temát i ca f i logenét i ca . Com o estabelecimento da sistemática filogenética por Willi Hennig em 1950 e sua difusão após a tradução para o inglês em 1966, a classificação biológica tornou-se mais precisa e fundamentada, baseada em regras práticas cujos fundamentos são de origem “biológica e embriológica” e assim propiciando o surgimento de uma nova escola classificatória, a Cladística [46]. Essa escola foi fundamentada no conceito de “navalha de Ockham” desenvolvido pelo filósofo inglês William de Ockham onde, a hipótese que requer o menor número de passos seria aquele mais plausível de ter acontecido. Com isso foi gerada a escola 15 árvore mais parcimoniosa é selecionada e utilizada na próxima etapa de pareamento. Esse procedimento continua até que toda a politomia esteja resolvida. Stepwise Adition: inicialmente um trio de táxons arbitrários são selecionados, após isso se adiciona os demais táxons um a um testando-os em várias posições. A cada adição de táxon para cada posição o número de passos é recalculado, as árvores, que a cada passo de incorporação apresentam o menor número de passos são selecionadas para o próximo passo de incorporação. Isso acontece até que todos os táxons sejam incorporados. O principal problema dessa metodologia é que o primeiro trio influencia toda topologia. Porém, esse problema pode ser amenizado testando-se vários trios iniciais. Branch Swaping: é a baseada em quebras e junções de ramos. Nessa metodologia uma árvore inicial é construída, essa árvore tem um ramo “quebrado” e esse ramo é novamente conectado à árvore, porém em posição diferente da inicial. Aquela árvore que apresentar um menor número de passos é selecionada e então passa para uma nova etapa de quebra e re-conexão. Esse rearranjo ocorre até que a árvore com um menor número de passos (para a análise) seja encontrada. Min-mini: é o modelo de busca promovido a partir da eliminação das árvores com as menores probabilidades de serem as mais parcimoniosas, e a partir daí executa-se a busca propriamente dita. Esse método permite que se estipule o número de árvores que serão selecionadas, e o tempo aumenta com o acréscimo de maior número de árvores. Contudo nesse método as árvores selecionadas podem não ser as mais parcimoniosas. (ver mais detalhes sobre os modelos de busca heurísticas nas referências [47]; [49]). 4.2.2 - Máxima Verossimilhança heurística. (ver mais sobre o método de parcimônia na referência [48]). A busca exaustiva avalia todas as possibilidades de parentesco e escolhe as árvores que apresentem o menor número de passos, ou seja, de todas as árvores filogenéticas possíveis a partir da busca exaustiva é possível encontrar aquela (ou aquelas) mais parcimoniosa. Porém, esse tipo de busca requer um tempo computacional muito elevado. Uma alternativa seria a busca exaustiva conhecida como branch-and-bound, onde uma heurística prévia é realizada determinando o número de passos X. Após essa etapa a busca exaustiva propriamente dita começa e nessa os táxons são adicionados um a um e quando, o valor de passos da árvore ultrapassa o valor X, essa árvore e todas as suas derivadas são eliminadas. Esse método reduz bastante o tempo de busca, porém para aquelas matrizes que apresentem um número de homoplasias bastante elevadas o tempo computacional é também elevado comparando-se à busca exaustiva convencional. O tipo de busca heurístico é realizado por vários algoritmos, cada um com virtudes e falhas. Porém, eles possuem em comum o baixo tempo computacional. Den t r e e l e s podemos des t a ca r : decomposição da politomia, stepwise adition, branch swaping e min-mini. D e c o m p o s i ç ã o d a p o l i t o m i a : inicialmente é gerada uma árvore completamente politômica, a partir desse passo os táxons são agrupados formando pares. A árvore que apresentar o menor número de passos é selecionada para a próxima fase. Nessa fase as duplas de táxons são tratadas como unidades, e então agrupa-se essas unidades novamente em duplas. Após essa etapa, o número de passos é novamente calculado, e também a 18 Tajima e Nei; Tamura-3-parâmetros, etc. O modelo de distância p baseia-se no número de diferenças pelo número de caracteres total, embora esse método pareça simples em demasia ele é o mais indicado na construção de topologias para matrizes que possuam taxa de divergência média menor ou igual a dois. Esse também é o modelo mais utilizado para taxas de divergência constante, e por isso é bastante usada em re lóg ios molecu la res , (discutiremos sobre relógios moleculares mais adiante nesse capítulo). Já o modelo de distância Jukes-Cantor [51] apresenta algumas diferenças. Uma delas é que esse método responde melhor em matrizes de caracteres menos conservados do que o anteriormente mencionado. Porém, também possui limitações. Taxas de divergência superiores a 0,75 não podem ser computadas. Para esse problema existe cálculo de correção, mas não é muito utilizado, pois uma matriz com caracteres tão pouco conservados perde o sentido sistemático. Alguns modelos de distância genética levam em consideração outros parâmetros. Um exemplo é o modelo de Kimura-2- parâmetros [52], que leva em consideração a taxa de transversão e transição. Já o modelo de Tajima e Nei [53] leva em consideração o conteúdo de citosina e guanina. O modelo de Tamura-3- parâmetros [54] leva em conta a divergência total, tal como as transversões, transições e a composição guanina/citosina. Embora esse último pareça o mais completo ele possui uma variância maior do que os demais. Outros modelos levam em conta não só o tipo, mas também a posição da substituição como, por exemplo, o modelo de distância Gama-Poisson que parte do fato de que todos os sítios de uma sequência codificante qualquer não possuam a mesma suscetividade a (Probabilística) O emprego de métodos probabilísticos para construção filogenética vem crescendo nos últimos anos. Esses métodos possuem um embasamento teórico mais sofisticado quando comparados aos de distância e os parcimônia. Esses métodos baseiam-se, de modo geral, no teste de probabilidade para cada substituição em uma determinada topologia, além do comprimento dos ramos. Por esse motivo esse tipo de metodologia implica em um tempo computacional muito elevado, tornando uma busca exaustiva de uma topologia com muitos táxons terminais impraticáveis. Contudo nesses casos tem sido comum o uso de buscas heurísticas para encontrar as topologias que se apresentem mais “prováveis” ou verossímeis. O método de busca que tem sido mais empregado para encontrar a topologia com máxima verossimilhança é o de decomposição da politomia. Esse método tem se mostrado mais eficiente do que os de distância e o de parcimônia em alguns aspectos. Entre eles o método de Máxima Verossimilhança apresenta uma variância menor, já que é menos afetado por erros de amostragem, até mesmo com sequências curtas. Esse método também tende a ser mais robusto a violações do modelo evolutivo (ver mais na referência [49]). Contudo o tempo computacional é fator limitante para o método. Outros métodos também estão sendo utilizados ultimamente para inferências filogenéticas, é o caso da análise Bayesiana. (ver mais sobre análise bayesiana na referência [50]). 4.2.3 - Modelos Geométricos (Distância Genética) Para a construção de uma matriz de distância genética podemos fazer uso de vários modelos, dentre esses podemos destacar os: Distância p; simples; Distância de Juckes-Cantor; Kimura-2-parâmetros; 19 tipo de análise encontra a árvore real. Porém, na prática a topologia encontrada é, na maioria das vezes, idêntica à encontrada por NJ. Existem modelos que testam as matrizes de dados e ramos das topologias do ponto de vista estatístico, dentre elas podemos destacar, índice de Bremer e bootstrap, dentre outros. O índice de Bremer quantifica o número de etapas necessárias para se decompor um determinado grupamento, ou seja, quanto maior o número de caracteres que sustentam um determinado grupamento maior será o número de passos necessários para sua decomposição e maior o índice de Bremer [59]. Já o teste de Bootstrap [55] busca montar réplicas da matriz, porém essas réplicas possuem alterações, onde alguns caracteres aparecem em duplicata enquanto que outros são retirados. Com isso podemos observar a porcentagem de matrizes que sustentam um determinado nó suportando assim estatisticamente esse grupamento. Esse teste tem sido muito utilizado em análises de cunho molecular. (ver mais detalhes sobre os modelos de busca heurísticas nas referências [47]; [49]). A partir de análises filogenéticas desses tipos mencionados (seja ela de Máxima Parcimônia, Probabilística ou de Distância Genética) é possível reconstruir a história evolutiva dos organismos analisados tal como auxiliar no entendimento da história evolutiva dos ambientes que esses organismos ocupam. O ramo da ciência que une tais conhecimentos é a Biogeografia. 5 - Organização Espaço-Temporal 5.1 - Biogeografia e a Filogeografia A Biogeografia, também conhecida como alterações. Os modelos de distância podem ser testados a partir de cálculo estatístico de bootstrap [55] para a escolha do melhor modelo para o seu conjunto de dados. Após a escolha do modelo de distância genética deve-se escolher os algoritmos de reconstrução de topologia. Existem alguns algoritmos bastante utilizados atualmente, dentre esses podemos destacar: UPGMA, agrupamento de vizinhos (Neighbour- joining) e evolução mínima. Os algoritmos de UPGMA [56] assumem o relógio molecular (discutido mais a diante) para inferir a topologia, ou seja, ele parte do pressuposto que a taxa de mutação é constante e igual em todos os táxons, agrupando os terminais que possuam a menor distância. Os algoritmos de agrupamentos de vizinhos (Neighbour-Joining) [57] são uma variante do algoritmo de evolução mínima, porém nesse caso o tipo de busca realizada é do tipo heurística. O tipo de busca é bastante semelhante ao de decomposição de politomias discutido anteriormente, ou seja, a cada passo da busca procura-se os vizinhos que minimize a somatória de passos para cada ramo. Os algoritmos de evolução mínima [58] buscam as topologias com menor comprimento de ramos, p o r é m a busca exaustiva dessa topologia é bastante laboriosa e em conseqüência, requer um grande tempo de cálculo. Quando se executa busca heurística, encontra-se um resultado muito similar ao encontrado pelo método de Neighbour-Joining. Com isso esse algoritmo sofreu alterações. Nessas alterações uma topologia inicial é construída a partir de Neighbour-Joining. A partir disso procura-se nas árvores mais próximas rearranjos que diminuam o tamanho total dos ramos. Testes computacionais demonstram que se o conjunto de dados não estiver viciado esse 20 Universidade de Brasília: Brasília, DF, 1998. 1107p. [47] Nei M., Kumar S. Molecular evolution and phylogenetics. 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Em função da intensidade do processo de degradação histórica dessas áreas, pode ser necessário um maior nível de complexidade nas ações de restauração ecológica para que se produzam comunidades vegetais auto-sustentáveis e com alta diversidade de espécies nativas, restabelecendo as interações ecológicas e os serviços ambientais, produto de ecossistemas equilibrados. Diante desses desafios, a ciência da restauração ecológica tem evoluído consideravelmente nos últimos anos e buscado uma visão mais integrada do processo, como pode ser observado na 1 – Degradação ambiental e a demanda pela restauração ecológica A restauração ecológica de ambientes naturais tem se destacado cada vez mais como uma forma de reverter a atual situação de degradação ambiental e promover a conservação da biodiversidade e dos recursos naturais para o uso das gerações presentes e futuras [1] [2]. Nesse sentido, a sociedade tem demandado cada vez mais ações que não só minimizem os impactos das atividades antrópicas no ambiente, mas também iniciativas de recuperação dos ecossistemas que foram irregularmente degradados no passado. Particularmente na Mata Atlântica, onde a ocupação histórica é mais antiga e intensa em comparação com os demais biomas brasileiros, os elevados níveis de degradação e fragmentação ambiental alteraram profundamente a estrutura e o funcionamento de seus ecossistemas, CAPÍTULO 02 RESTAURAÇÃO ECOLÓGICA DE FLORESTAS TROPICAIS. Pedro H.S. Brancalion Laboratório de Ecologia e Restauração Florestal - ESALQ/USP – Piracicaba - SP pedrohsb@yahoo.com.br Sergius Gandolfi Laboratório de Ecologia e Restauração Florestal - ESALQ/USP – Piracicaba - SP sgandolf@esalq.usp.br Ricardo Ribeiro Rodrigues Laboratório de Ecologia e Restauração Florestal - ESALQ/USP – Piracicaba - SP rrr@esalq.usp.br Resumo: Este capítulo apresenta alguns dos principais conceitos e práticas envolvidos na restauração ecológica de florestas tropicais. Foi discutida, ao longo do texto, como a ecologia da restauração evoluiu como ciência e como tal evolução se traduziu em modificações na forma de se restaurar ambientes degradados. A prática da restauração ecológica foi apresentada por meio de uma chave para a definição de metodologias específicas para cada situação encontrada, definidas a partir do diagnóstico ambiental, além de terem sido apresentados alguns dos métodos utilizados na avaliação e monitoramento de áreas em processo de restauração. 24 termo “restauração” passou a ser mais empregado, justamente por se buscar a reestruturação do ambiente degradado tal como ele era antes das perturbações. Além do uso de elevada diversidade florística regional, passou-se também a incorporar conceitos da dinâmica florestal na reconstrução de florestas nativas em ambientes degradados, com destaque para a sucessão ecológica. De forma geral, a sucessão ecológica pode ser descrita como um fenômeno no qual uma dada comunidade vegetal é progressivamente substituída por outra ao longo do tempo e em um mesmo local. Baseados nas teorias de dinâmica de populações desenvolvidas em florestas tropicais, nas quais se observou que a sucessão florestal se dá a partir da substituição gradual de espécies com diferentes comportamentos [4], os pesquisadores passaram a interpretar as áreas em restauração principalmente sob a ótica da dinâmica de clareiras. Após a classificação das espécies nos grupos ecológicos, o passo seguinte foi aplicar o entendimento do processo de substituição dessas espécies na sucessão à prática da restauração florestal. Chegou-se a conclusão de que os locais a serem restaurados representavam áreas em fase inicial da sucessão, cujo caminho a ser seguido para a formação de uma floresta madura deveria passar, necessariamente por esse processo de substituição de espécies no tempo. Além disso, confirmou-se que a inserção do conceito de sucessão florestal nesses projetos permitia um recobrimento mais rápido do solo a partir do desenvolvimento da copa das espécies pioneiras plantadas, reduzindo consequentemente os custos de manutenção e, mais do que isso, o tempo necessário para a formação de uma fisionomia florestal. definição da Society for Ecological Restoration International: “restauração ecológica é a ciência, prática e arte de assistir e manejar a recuperação da integridade ecológica dos ecossistemas, i n c l u i n d o u m n í v e l m í n i m o d e biodiversidade e de variabilidade na estrutura e funcionamento dos processos ecológicos, considerando-se seus valores ecológicos, econômicos e sociais”. Assim, muito mais do que meros plantios de árvores, a restauração ecológica tem evoluído no sentido de restabelecer parte significativa da diversidade florística e genética das espécies vegetais de uma dada região, restabelecendo as complexas interações ecológicas que geram em mantêm a biodiversidade em ambientes tropicais. 2 – Evolução da restauração ecológica como ciência No princípio dos trabalhos de restauração no país, tinha-se como objetivo principal a mitigação dos impactos ambientais decorrentes do uso e ocupação irregulares do solo. Assim, a formação de uma fisionomia florestal já era suficiente para que tais problemas fossem parcialmente equacionados. Nesse período, o uso de espécies arbóreas exóticas, e muitas vezes invasoras, era uma realidade, já que o plantio de espécies de maior rusticidade e de crescimento mais vigoroso reduzia o custo e o tempo para que formasse uma floresta na área. Contudo , com a evo lução do conhecimento, a ecologia da restauração passou a ter uma dimensão mais abrangente, contribuindo não só para a mitigação dos impactos ambientais, mas, sobretudo, para a conservação da biodiversidade regional. A partir dessa nova visão do processo, o 25 conservação, manejo e restauração para cada uma das situações identificadas, conforme os potenciais de auto- recuperação apresentados. Para facilitar a tomada de decisão e a escolha do(s) método(s) de restauração mais apropriado(s) para cada situação ambiental em particular, será apresentada uma Chave para a definição das ações de restauração ecológica para áreas degradadas. Exemplo de chave para a definição das ações de restauração ecológica de áreas degradadas (LERF/LCB/ESALQ/USP) 1. Condições do solo do local 1a. Solo degradado ........................item 7a 1b. Solo não degradado ....................item 2 2. Ocupação da área 2a. Campos úmidos ........................ item 7j 2b. Áreas abandonadas ................... item 3 2c. Pastagens .................................. item 3 2d. Áreas agrícolas .......................... item 3 2e. Florestas comerciais .................. item 5 2f. Formações naturais .................... item 6 3. Espécies exóticas invasoras 3a. Presença de espécies exóticas invasoras ...................................................... item 7e 3b. Ausência de espécies exóticas invasoras ....................................................... item 4 4. Estado de desenvolvimento da regeneração natural (áreas abertas ou sub- bosque) 4a. Ausência de regeneração natural ...................................................... item 7f 4b. Baixa expressão da regeneração natural ........................................ itens 7g, 7h e 7i 4c. Alta expressão da regeneração natural, com baixa d ivers idade f lor ís t ica .............................................. itens 7g e 7i 4d. Alta expressão da regeneração natural, c o m a l t a d i v e r s i d a d e f l o r í s t i c a ..................................................... item 7g 5. Florestas comerciais 5a. Sem regeneração natural de espécies para a sua adequação legal e/ou ambiental. Normalmente o zoneamento ambiental é iniciado através da análise de imagens aéreas ou de saté l i te do loca l , preferencialmente as mais recentes, com resolução menor que 2,5m2/pixel e com escala que permita uma boa visualização (se possível menor que 1:15.000). Esse p r o c e s s o , d e n o m i n a d o d e fotointerpretação, é realizado através de softwares compatíveis, especialmente aqueles que permitam a construção de um Sistema de Informações Geográficas (SIG), onde é possível gerar bancos de dados com nomes das situações, área, características espec í f i cas ou qua isquer out ras informações, conforme objetivos do trabalho. A checagem de campo é a atividade subseqüente à fotointerpretação. Consiste em visitas de campo às áreas abrangidas no trabalho de adequação, tendo em mãos cópia dos mapas, preferencialmente já fotointerpretados, para confirmar as situações identificadas em computador, atualizá-las em relação ao uso atual (já que as imagens geralmente são alguns de alguns anos antes), detalhá-las com mais precisão e corrigir eventuais falhas ocorridas durante a análise das imagens. Essas correções podem ocorrer devido às alterações de uso da área posteriores à data dessas imagens, ou mesmo a erros de interpretação no momento da análise da foto. Importante registrar a data da realização da checagem para que conste no mapa final. Quanto mais detalhada for a checagem de campo, mais fiel será o mapa final. O zoneamento ambiental é o ins- trumento essencial do programa de adequação ambiental e de planejamento da implantação de ações de restauração ecológica, possibilitando que sejam adotadas ações diferenciadas de 28 desenvolvimento do projeto de restauração, de forma que eventuais problemas com o mesmo possam ser diagnosticados e corrigidos antes que todo o trabalho se perca, tal como ocorreu no passado com o uso excessivo de espécies pioneiras. De forma geral, a avaliação (ato ou efeito de avaliar) e o monitoramento (mensuração contínua de certos parâmetros ambientais ou populacionais, indicadores do funcionamento e dinâmica de ecossistema) de áreas em processo de restauração abrangem aspectos mais amplos do que apenas a avaliação puramente fisionômica da área restaurada, mesmo que periódica. Os indicadores de restauração devem avaliar também a reconstrução dos processos ecológicos mantenedores da dinâmica vegetal, de forma que áreas restauradas sejam sustentáveis no tempo. Os indicadores de aval iação e monitoramento de áreas em processo de restauração podem ser divididos em três subgrupos: Fase de implantação (1–12 meses) Fase pós-implantação (1-3 anos) Fase de vegetação restaurada (4 ou mais anos) Na Fase de Implantação (1 a 12 meses após adoção de ações de restauração, como isolamento e condução da regeneração natural, plantio total, etc.), são utilizados parâmetros como a avaliação do solo- substrato, existência de cobertura vegetal na área (mesmo que herbácea), cobertura do solo por gramíneas exóticas agressivas, profundidade da cova (no caso de plantios) e avaliação dos indivíduos plantados ou regenerantes naturais (identificação taxonômica; altura dos indivíduos e cobertura da área conferida pela copa dos mesmos; classificação quanto à nativas no sub-bosque ................ item 7b 5b. Com regeneração natural de espécies nativas no sub-bosque, em áreas de difícil acesso ........................................... item 7c 5c. Com regeneração natural de espécies nativas no sub-bosque, em áreas de fácil acesso .......................................... item 7d 6. Estado de conservação da vegetação nativa 6a. Fragmentos de vegetação nativa com necessidade de restauração....................... ..................................... itens 7g, 7h, 7i e 7j 6b. Fragmentos de vegetação nativa passíveis de restauração ........... itens 7i e 7j 6c. Fragmentos de vegetação nativa conservados 7. Ações de restauração florestal 7a. Recuperação do solo .................. item 2 7b. Colheita da madeira por meio de técnicas tradicionais ...................... item 7e 7c. Morte das árvores em pé ............. item 4 7d. Retirada da madeira com técnicas de baixo impacto ................................. item 4 7e. Eliminação de espécies exóticas invasoras ........................................ item 4 7f. Introdução de espécies nativas em área total (sementes ou mudas) 7g. Condução da regeneração natural 7h. Adensamento 7i. Enriquecimento 7j. Controle de processos erosivos e restauração florestal do entorno (zona tampão) 8. Ações complementares 8a. Implantação de corredores ecológicos 8b. Implantação de poleiros naturais e/ou artificiais Embora as metodologias de restauração e c o l ó g i c a t e n h a m a v a n ç a d o consideravelmente nos últimos anos, as chances de insucesso nessa atividade ainda são grandes, principalmente em paisagens altamente fragmentadas. Em função disso, é primordial que se realize o acompanhamento do 29 Atlantic Forest. Biological Conservation, 2009 (no prelo). regionalidade, grupos sucessionais e síndrome de dispersão; indícios de ataque por formigas e de deficiências nutricionais, densidade e riqueza). Na Fase Pós-implantação (1-3 anos), praticamente são avaliados os mesmos parâmetros da Fase de Implantação, mas adicionalmente é também avaliada a cobertura da copa dos indivíduos regenerantes ou p lantados, e o florescimento e frutificação dos mesmos. Já na fase de vegetação restaurada (4 ou mais anos), passa-se também a avaliar os aspectos fisionômicos da vegetação, tal como a presença ou não de estratos na floresta, a identificação e a densidade de indivíduos do sub-bosque, do sub-dossel, do dossel e emergentes. Além disso, também é contemplada a avaliação da chegada de outras formas de vida na área restaurada (espécies herbáceas, arbustivas, epífitas, lianas) e o resgate da fauna nativa do local. 4 – Referências bibliográficas [1] DOBSON, A.P.; BRADSHAW, A.D.; BAKER, A.J.M. Hopes for the future: restoration ecology and conservation biology. Science, v.277, p.515- 522, 1997. [2] LAMB, D.; ERSKINE, P.D.; PARROTA, J.A. Restoration of degradated tropical forest landscapes. Science, v.310, p.1628-1632, 2005. [3] WUETRICH, B. Biodiversity: reconstructing Brazil's Atlantic Rainforest. Science, v. 315, p.1070- 1072, 2007. [4] BUDOWSKI, G. Distribution of tropical American rain forest species in the light of sucessional process. 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On the restoration of high diversity forests: 30 years of experiences in the Brazilian 30 É preciso destacar aqui que grande parte deste capital acumulado em decorrência do crescimento econômico foi e ainda continua ser utilizado para a amplificação da própria escala da economia e não para auxiliar na reorganização das relações humanas deterioradas pelo próprio ganho de escala da economia mundial [1]. Assim, é possível resumir que o modelo atual de desenvolvimento foi construído e está pautado, sobretudo, no crescimento econômico, não preconizando diretamente que seus benefícios sejam prontamente estendidos à melhoria das condições humanas. 2 – Contradições do atual modelo de desenvolvimento Mas quais são as implicações de se considerar desenvolvimento tão so- mente como crescimento econômico, representado principalmente pela busca contínua no incremento dos produtos internos brutos? Além de não reorientar seus benefícios para a melhoria das relações humanas, como já destacado, é importante conceber que o aumento da escala da economia, de acordo com os moldes tradicionais, amplifica de forma acelerada a depleção dos estoques de recursos naturais (dotados de baixa entropia) e a deposição de matéria residual e energia com alto grau de entropia, o que de acordo com Branco [2] são formas expressas de degradação ambiental. Ou seja, há produção de entropia em taxas crescentes pelo sistema econômico. Ainda que a degradação ambiental (aqui considerada também a dimensão social, a qualidade de vida das populações e as relações humanas na sociedade) seja uma evidente externalidade negativa do funcionamento do sistema econômico, deve-se também compreender que ela é comumente desconsiderada dentre as políticas de desenvolvimento, já que estas e s t ã o m u i t o m a i s f o c a d a s n o comportamento dos produtos internos brutos, como os estandartes do modelo tradicional de desenvolvimento. Veiga [1] mostra que atribuir esta dimensão ao produto interno bruto, ou seja, resumir o desenvolvimento apenas ao crescimento econômico, implica a desconsideração da depreciação de ativos que resulta do processo produtivo na equação do desenvolvimento, como é o caso, por exemplo, da deterioração da qualidade de vida da sociedade, do aumento da vulnerabilidade ambiental dos ecossistemas ou da própria perda global da biodiversidade. Por fim, revela-se um paradoxo termodinâmico contido no funcionamento do processo produtivo, de acordo com o pensamento econômico tradicional: Ÿse a economia deve sempre ter sua escala de funcionamento amplificada para prover acúmulo de capital responsável pelo desenvolvimento; Ÿe se para isto, o funcionamento da economia converte formas de matéria e energia de baixa entropia em formas mais entrópicas a taxas sempre crescentes; ∴ Como pode o sistema econômico sustentar-se, se o seu funcionamento resulta em aumento acelerado do seu próprio grau de entropia e, portanto, na sua própria desorganização interna? Para resolver este problema e não desrespeitar tão frontalmente a segunda lei 33 da termodinâmica, o pensamento dominante da economia tradicional tratou de reduzir o seu universo de análise a um sistema fechado praticamente restrito aos processos produtivos, deixando para fora dos limites o compartimento ambiental onde repousa a crescente quantidade de entropia produzida pelo próprio sistema econômico. Além disso, tratou de considerar o compartimento ambiental como se fosse dotado de capacidades ilimitadas de suportar os processos produtivos e de assimilar a matéria residual e a energia de alto grau entrópico dele derivadas. Portanto, de acordo com a construção da economia tradicional, se a crescente entropia produzida repousa em um compartimento externo aos limites do sistema econômico e se este com- partimento é dotado de capacidade ilimitada para assimilar tal grau de entropia, estar-se-ia desfeito o aparente paradoxo termodinâmico e o sistema econômico não tenderia ao caos na sua organização interna. Embora evidentemente equivocada, esta concepção foi e até hoje está vigente no pensamento econômico dominante, ainda que esteja claro que o sistema econômico não está em hipótese alguma isolado de sua própria entropia produzida, como já têm muito propriamente preconizado as abordagens da economia ecológica iniciadas ao final do século XX. E também não foi por outro motivo que a Economia e Ecologia dicotomizaram-se ao longo da sua história. A Economia tratou de analisar os fluxos de matéria e energia em um sistema fechado, circunscrito ao processo produtivo, comprometido com o aumento da escala dos produtos internos e que descons idera os compartimentos ambientais que servem de fonte de recursos ou de depósito de matéria residual e energia entrópica. Por outro lado, a Ecologia comprometeu-se com um universo de análise com limites mais amplos, considerando os compartimentos que o Economia tradicional de contemplar historicamente. Em resumo, o incremento científico e tecnológico baseado numa abordagem reducionista e altamente especializada, o estabelecimento de um padrão de consumo na sociedade e o contínuo aumento da escala da economia sem considerar a degradação ambiental derivada de seus próprios processos produtivos, foram os elementos estruturantes do atual modelo de desenvolvimento, do qual derivam o aumento contínuo das solicitações de recursos naturais e das pressões para o meio ambiente. E por fim, como a economia tradicional concebe que o sistema econômico funciona a partir da existência de fontes inesgotáveis de recursos naturais e da capacidade ilimitada de assimilação de matéria residual ou energia entrópica, resultante dos processos produtivos e do consumo [3], por muito tempo não se reconheceu, portanto, a degradação ambiental decorrente do funcionamento do próprio sistema econômico e os limites naturais para o crescimento. 3 – A emergência das questões ambientais e de um novo paradigma A partir de meados do século XX, com o aumento expressivo das economias de 34 diversos países e, portanto, da escala do próprio sistema econômico, os problemas ambientais decorrentes das intensas solicitações e pressões sobre o meio ambiente tornaram-se mais evidentes e puderam ser melhores compreendidos como falhas ou externalidades negativas do funcionamento do próprio sistema econômico. Não foram raros os episódios c a t a s t r ó f i c o s q u e i l u s t r a r a m o func ionamento fa lho do s is tema econômico, como foi o caso do evento crítico de poluição atmosférica na cidade de Donora nos Estados Unidos, em 1948, quando centenas de pessoas morreram em poucos dias e diversas unidades industriais de um pólo siderúrgico foram paralisadas. Outros de natureza crônica, como os efe i tos inter e intra-gerac ionais decorrentes da contaminação por mercúrio das águas da baía de Minamata no Japão, entre os anos de 1941 e 1971, resultando em distúrbios neurológicos, em mortes e em malformações genéticas em cerca de 3.000 pessoas, o que levou o Estado a obrigar a empresa Chisso-Minamata a indenizar a população afetada e, posteriormente, a encerrar as suas atividades [4]. N o c a s o d o s p a í s e s s e m i - industrializados, como o Brasil, o crescimento vultoso vivenciado na segunda metade do século XX pela economia também não se traduziu em distribuição de renda e em melhoria da qualidade de vida, ou seja, não tratou de reorganizar as relações humanas deterioradas pelo próprio ganho de escala da economia mundial. Ainda durante as décadas de 1960 e 1 9 7 0 , a d i s c u s s ã o e n t r e desenvolvimento e meio ambiente esteve mundialmente polarizada por duas posições ideológicas controversas, de acordo com Sachs [5] e Veiga [1]: Ÿ os otimistas (panglossianos ou maníacos pelo crescimento): baseados na visão otimista de que era naturalmente possível conciliar o modelo vigente de desenvolvimento com a adequada proteção ambiental; Ÿ e os pessimistas (catastrofistas): alicerçados na previsão alarmante do “Os Limites do Crescimento”, de que o sistema econômico estava à beira de um colapso pelo fato dos limites naturais estarem sendo ultrapassados. Neste contexto ideológico, foi realizada a Conferência das Nações Unidas sobre o Meio Ambiente Humano, em 1972, na cidade de Estocolmo na Suécia, como um marco internacional de mobilização política de representantes de países, da comunidade científica e da sociedade civil, no sentido da busca de alternativas para a r eo rgan ização da r e l a ção en t r e desenvolvimento e meio ambiente que compatibilizasse crescimento econômico, conservação ambiental e qualidade de vida. Foi nesta ocasião que começou a se organizar o novo ideário para o desenvolvimento cunhado inicialmente como Ecodesenvolvimento, até a edificação mais completa como Desenvolvimento Sustentável, por meio da publicação “Nosso Futuro Comum” pela Comissão Brundtland, em 1988 [6]. Se para o mundo, a Conferência de Estocolmo em 1972 foi um marco positivo na busca de um novo ideário para o desenvolvimento, para o Brasil este não foi o sentimento predominante, uma vez que a 35 [2] BRANCO, S.M. Ecossistêmica: uma Abordagem Integrada dos Problemas do Meio Ambiente. 2ª reimpressão. São Paulo. Editora Edgard Blüncher LDTA. 2002. 202p. [3] MÜLLER, C.C. Os Economistas e as Relações entre o Sistema Econômico e o Meio Ambiente. Brasília. Editora UNB. 2007. 561p. [4] BRAGA, B.; HESPANHOL, I.; CONEJO, J.G.; BARROS, M.T.L.; VERAS, Jr., MILTON, S.; PORTO, M.F.A.; NUCCI, N.L.R.; JULIANO, N.M.A.; EIGER, S. Introdução à Engenharia Ambiental. São Paulo. Prentice Hall. 2002. 318p. [5] SACHS, I. Sociedade, Cultura e Meio Ambiente. Mundo & Vida. Vol 2(1): 2000, p. 7-13. [6] SANTOS, R.F. Planejamento Ambiental: Teoria e Prática. São Paulo. Oficina de Textos. 2004. 184p. [7] FURTADO, C. O Mito do Desenvolvimento Econômico. Rio de Janeiro. Paz e Terra. 1974. 117p. [8] TUCCI, C.E.M.; MENDES, C.A. Avaliação Ambiental Integrada de Bacia Hidrográfica. Brasília. Ministério do Meio Ambiente. 2006. 302p. [9] Moretto (2008). Análise da argumentação dialética que considera o Licenciamento Ambiental um impeditivo ao Desenvolvimento Econômico do país: premissas, interesses e possibilidades de superação. Livro de Resumos do IV Encontro Nacional da Associação Nacional de Pesquisa e Pós –graduação em Ambiente e Sociedade. 2008. 38 1 – Introdução Vida de professor cansa! Pois é, muitas vezes meus alunos me perguntam “Professor o Senhor Não trabalha não?”, respondo “E como”, chego muitas em casa às 23h (e já havia saído às 06h30minh). E muito diferente de como muitos pensam, às vezes passo o dia todo “vendendo” aulas e ainda tenho outros trabalhos para terminar. Mas ser professor faz parte da minha vida e isso tudo também faz parte da vida de professor, certo? Mas às vezes parecer pior quando você tem diversos trabalhos ou escolas onde é professor, e aí você entra mais cedo ainda em sala e sai bem tarde, pois têm que dar conta de suas aulas, em várias escolas, palestras consultorias e publicações, e aí lá se vai o fim de semana. Mas adoro o que faço, principalmente quando participo de feiras e congressos, Marina Faleiros em seu texto para o Jornal O Estado de São Paulo e publicado no site www.universia.com.br, fala muito da experiência que nós encontramos quando damos aula, a capacidade de nos renovar, de voltar ao estado da arte, do assunto que vamos tratar e também como é importante e revigorador o ambiente universitário, onde as idéias fluem. Foi a partir dessas reflexões que quando, neste mês, que fui convidado pelos organizadores do evento para ministrar um mini-curso na minha área de atuação, que quis realmente fazer este trabalho. Mas durante estes meses de preparação para o mini-curso, fiquei refletindo e também preocupado em trabalhar com os participantes que se imaginam como eu, no passado, “quando nunca havia dado uma aula na vida”. Mas tirem a preocupação do coração, pois é disso que vamos tratar, e hoje já se sabe que podemos hoje aprender 90% do que se vai usar no dia-a-dia pela internet e livros, posso falar, pois isto é uma realidade para mim. E foi a partir daí que “caiu a ficha” que de repente teria de perguntar a mim mesmo: “Como ensinar dar aulas, a quem já tem acesso a uma gama tão grande e diversificada de informações e ainda por ser um centro de excelência da produção cientifica?” Que parte pequena e importante eu poderia discutir com esse público, que agregue novos conhecimentos, ou mesmo técnicas, lembrando ainda que como tudo esta tão disponível, foi aí que me lembrei da noção do humano, do relacionamento pessoal, que não temos com as maquinas e que os livros ainda não podem nos ensinar com calor humano e fazer concorrência. A noção de que muitos aqui estão aqui para, complementar sua formação, ampliar novos horizontes, mas não quero colocar CAPÍTULO 04 PROFESSORES BRILHANTES, AULAS FASCINANTES. Paulo Roberto da Fonseca Professor, pedagogo, consultor e especialista em educação empresarial professorpaulo@professor.sp.gov.br Resumo: Nossa preocupação com este pequeno ensaio é apresentar de forma clara e objetiva um material que apresentará um pequeno resumo das apresentações e as diretrizes básicas para organização e preparação de palestras como também de condução de aulas, visando com isso formar complementarmente palestrantes, monitores, coordenadores no domínio de técnicas básicas de apresentação em público e comentários sobre o domínio de salas que podem ser usadas desde o Ensino Fundamental até a Universidade 39 ninguém numa fôrma, pois a todo o momento novas formas de produção de conhecimento pipocam a todo instante pelo mundo. Nossa preocupação então sobre caiu: como nós aqui podemos aprender a posar na frente da sala destilando um "blá blá blá" de uma hora que poderia ser capturado por qualquer um deles, a qualquer momento, em centenas de fontes diferentes e ainda se tornar brilhante e interessante. 2 – Vinte dicas para usar em reuniões, em sala de aula e na escola. Muita gente me pergunta sobre dicas para dar aulas, fui executivo de um grande banco e responsável por recursos humanos por um período e agora sou professor mesmo, cumprindo desafios no Ensino Médio Estadual, na Educação Empresarial e em faculdades, efetivamente desde 2005. As coisas vêm mudando muito daquela época para cá! Um exemplo é a informática, os micros mais rápidos eram Pentium III, o Speedy estava engatinhando com sua super velocidade de 256kbps, a moda em sites eram aberturas gigantescas em Flash, ninguém conhecia o Orkut, Blogs eram diários pessoais, profundo não? Porém o que mais mudou nesses quatro anos chama-se “Inclusão Digital”. Desse tempo para cá, computadores venderam como água (em 2007, venderam mais que televisores) e a maioria das casas passaram a ter um computador. A nova geração as crianças nasceram com um computador em casa e usam o celular diariamente. É por esse motivo que dar aulas para as gerações mais novas não é apenas mostrar como são os equipamentos da informática “isso é um mouse”, “isso é um monitor”. Dar aulas é muito mais é aprender a se relacionar com as pessoas geralmente de uma geração “mais moderna” que a sua, bem como sou especialista em educação empresarial, repasso neste pequeno artigo dicas do que encontrei se sucesso até hoje. 2.1 – Trate como gostaria de ser tratado Quando comecei a dar aulas os alunos estranharam de me desculpar quando errava e por várias vezes escutei o comentário “Puxa! Você é o único professor, aqui, que trata a gente de igual para igual”. Será que eu era muito educado ou tratava- os como “responsáveis”? Bem na verdade algumas dicas ajudam muito. Podemos citar, por exemplo, criar vínculos é uma delas, e sempre quando for falar com as pessoas em particular (não durante a exposição) abaixe o tom da sua voz, nunca fale mais alto que seu interlocutor, fique na altura da voz deles. Também não trate os ouvintes como “desconhecidos” ou ainda de “zerados” de conhecimento, isto ajuda bastante. Outra coisa que também ajuda é usar imagens e figuras: na sala de aula isso aguça a imaginação e ajuda muito. Ouvir música ou colocar músicas que chamem a atenção também, em aula dinâmica deve fazer parte. E às vezes tem até que fazer uma coreografia e até decorar a coreografias como "Ragatanga", fica realmente interessante. Resumindo, use o humor também. 2.2 – A importância do convívio Entender como funciona a cabeça dos discentes é outro fator importante. A experiência de conviver com eles sempre bem de perto é muito diferente de apenas chegar encima da hora todo dia. Principalmente porque são pessoas e as pessoas gostam de se conhecer e os sentimento uns dos outros. Isso explica porque muitos alunos sempre partem para 40 Caso você nunca tenha dado aula e vai ser sua primeira experiência, peça para coordenadora estar presente ou passar sempre por ali (não muito também) é nessa hora que um curso de extensão sobre Didática e Pedagogia vão fazer falta. 2.19 – Discipline-se E discipline-se sempre que possível, monte seu cronograma de aulas em cima do cronograma de aulas factível de outros professores para tornar tudo mais interessante, mas siga-o, isso chama transversalidade. 2.20 – Respeitando A dica mais importante lembre-se são pessoas, gostam de respeito e serem respeitados, são amorosos por natureza, Deus os fez assim, procure mostrar também que você é humano e Deus está presente na sua vida, sem entrar muito na religiosidade. Apenas seja sincero e reto, e leia a Bíblia, no mínimo você sempre terá uma história pra contar. 3 – Falando em público Escolhi este tipo de recurso discursivo para poder atender às expectativas da maioria dos leitores, um roteiro com respostas às perguntas mais comuns formuladas. Vou apresentar as mais comuns organizando-as por ordem de relevância 3.1 – Ficar nervoso Quando vamos falar em público ficamos todos muito nervosos, o coração acelera, as mãos suam, as pernas tremem, a voz enrosca na garganta, e até os pensamentos somem, como também a concentração. E aí como você pode acabar com isso? Simples, domínio do assunto essa é a frase mágica que faz com que o nervosismo desapareça num passe de mágica. Mas para combater então esse mal, é necessário dominar o conteúdo, muito estudo e dedicação. Precisamos saber que o nervosismo é uma conseqüência de medo. Que dispara nossas glândulas supra-renais liberam adrenalina no organismo para enfrentar o perigo e fortalecer os músculos, ação primitiva que nos prepara para fugir rapidamente de uma situação de perigo. Então é normal veja: ficamos com medo de que? do público está ali na nossa frente aguardando que façamos a nossa apresentação. Assim, como não nos movimentamos como deveríamos nos movimentar se estivéssemos fugindo, a adrenalina não é metabolizada e permanece mais tempo do que deveria no organismo e provoca esse nervosismo todo. Conhecer o assunto com a maior profundidade possível e ordená-lo de forma lógica e concentrada; Treinar bastante o uso da palavra em público para ter prática e adquirir experiência; Aprender a identificar as qualidades de comunicação que você possui. Mas existe um ponto positivo da adrenalina ao nosso favor, ao contrário, um pouco de adrenalina não atrapalha, até ajuda, pois se transforma em energia positiva e ajudá-lo a falar com mais disposição e entusiasmo. 3.2 – E as mãos Quem já não percebeu que ao falar em público as mãos sobram, o que fazer com elas? Não se preocupe: suas mãos não vão cair. Use-as como você estivesse em uma conversa com a família e amigos e é até permitido gesticular muito. Só temos que tomar cuidado com os gestos, pois muitos sem querer fazem gestos de sentido dúbio e 43 até obscenos, o que pode ser sanado com muito ensaio. Mas se tiver de optar entre a falta e o excesso de gesticulação, prefira a falta. Procure também ensaiar gestos moderados, acima da linha da cintura e sem pressa de voltar com as mãos a uma posição de apoio. Nossa preocupação será agir de forma mais normal possível. De forma objetiva e simplificada, a regra é usar as mãos para explicar com as mãos e com moderação, ajudando o que você está dizendo. 3.3 – Onde ficar Onde se posicionar diante do público? Podemos nos movimentar? Uns falam que devem e outros falam que não, parado é melhor, qual será então o ideal? Ambos os pontos de vista estão corretos, mas se você ficar imóvel diante do público, dificilmente conseguirá a atenção dos ouvintes, mas se você se movimentar demais, poderá perder a objetividade, e sua imagem será de alguém inseguro, hesitante e sem convicção. Assim, o melhor é posicionar-se naturalmente sobre as duas pernas, com muito equilíbrio, sobre o seu corpo e procure se movimentar quando houver rea lmente necess idade como ao aproximar-se da platéia que fica desatenta, ou dar ênfase a determinadas informações importantes. 3.4 – A voz não é bonita Realmente muito poucas pessoas gostam de ouvir sua própria. Voz mesma que seja gravada e assim não a usam com eficiência, mas Isso ocorre porque quando falamos ouvimos a voz pela ressonância óssea dentro da nossa cabeça e a voz gravada é propagada por ondas no ar, por isso, muito diferente daquela que ouvimos quando falamos, acostume-se com a voz gravada ela é sua verdadeira voz é como as pessoas ouvem. Uma coisa importante, porém na voz é trabalhar a dicção. Quanto mais clara for a pronúncia das palavras mais facilmente as pessoas i r ão compreender suas informações e mais credibilidade você terá pela demonstração de bom preparo e boa educação. O outro aspecto que deve ser dado ênfase é no volume, a altura deve corresponder ao ambiente, por isso chegamos cedo aos salões e muitos de nós nos encontramos gritando. Muitos usam um gravador no fundo da sala para verificar a chegada do som, importante isso, sem dúvida. Também não podemos esquecer-nos da velocidade quando mais lenta com entonação melhor. Assim, recite poesia, é sensacional. 3.5 – Vocabulário Embora tenhamos medo de não saber o que falar e que vocabulários usar, mas pare de se preocupar, tenha uma atitude positiva em relação à platéia “Eles vão me entender”, seja você mesmo, mas tente evitar regionalismos, mesmo que o regionalismo para alguns palestrantes é sua marca registrada Assim não queiram ser diferentes disso s im poderá causar problemas e constrangimentos, fale como você conversa sem constrangimentos Muitas pessoas para ampliar o vocabulário passam a ler revistas com um dicionário perto ou anotam palavras para depois verem seu significado passando usar depois em seus textos e conversar diárias. Mas evitem sim gírias e palavrões pesados. 44 3.6 – Encantando a platéia – a seqüência Não há segredo, para se iniciar não há outro caminho “Tem que se começar do início”, temos que antes jogar no papel ter o tema principal ou fonte como abertura e a partir daí ordenar o pensamento nessa ordem, pois você saberá automaticamente o que dizer mesmo que tudo falhe (mídia, retroprojetor e flip-chart), a idéia principal então é “organizar as idéias”. A seqüência que eu sempre trato e acho aproveitável é entre introdução e conclusão passando por: ŸIntrodução - você deve ter uma introdução ao assunto ŸHistórico - contar qual é o assunto; ŸProblema - Detalhar um problema (se houver) a ser solucionado ou refazer um histórico do tema atual; ŸSolução - Dar a sugestões para problema ou falar do presente. Usando sempre argumentos de que dispõe e defendê-los. Você deve conhecer muito do assunto, lembre-se. ŸConclusão - Concluir pedindo que reflitam ou aceitem a proposta. É natural usar em cada um desses, itens que fortalecem as apresentações das mensagens como pesquisas, gráficos, frases, que quebram muito as resistências ao tema. Ao iniciar use um quebra gelo, usando elogios sinceros a ouvintes ao local, talvez contanto uma pequena história que possa ligar ao assunto tema, isso fará que surja uma reflexão desde o início dos trabalhos, mas não se esqueça cumprimento todos novamente mesmo que o grupo seja pequeno é uma cordialidade necessária Na conc lusão f ina l , peça aos participantes um reflexão sobre a proposta e tema apresentado ou discutido, pois conclusões complexas causam muitas vezes um descontrole e um mal estar, melhor evitar. Depois de algum tempo desenvolvi junto com colegas as técnicas para praticar uma apresentação, cujo resumo eu passo a vocês: ŸFaça apresentações curtas, de um minuto e meio a dois minutos, em uma sala fechada. ŸFale de uma viagem interessante que realizou, de como conquistou seu emprego, de um desafio que tenha enfrentado e superado. ŸVocê poderá também fazer uma homenagem a um amigo ou a uma pessoa conhecida. . ŸImagine que as pessoas estejam na sala assistindo à sua apresentação e certifique-se de que elas estariam ouvindo e entendendo bem sua mensagem. ŸSiga as orientações dadas para a voz, para o vocabulário e para a expressão corporal. Observe também a seqüência sugerida para a ordenação da fala. ŸTreine várias vezes a mesma apresentação até sentir que está falando com desenvoltura. Então aqui neste pequeno ensaio nos preocupamos em que vocês possam receber informação nossa e com certeza usar as dicas e técnicas de apresentação com seus futuros alunos e ouvintes Assim vamos aproveitar nossas aulas que serão apenas neste final de semana e bolar uma forma diferente de torná-los bons professores, palestrantes e coordenadores de salas a partir de uma experiência lúdica e prática sobre o relacionamento humano e cristão aplicado em sala de aula, nos tornando professores brilhantes com aulas interessantes. 45 e s s e n c i a l p a r a o i n i c i o d o desenvolvimento dos medicamentos genéricos. [4] O código de Nurnberg não foi suficiente para eliminar os abusos ocasionados na pesquisa com seres humanos. Foi com este intuito que surgiu a Declaração de Helsinki em 1964, em que foram estabelecidos os princípios para proteção de indivíduos nas pesquisas clínicas por profissionais qualificados. Na mesma foram definidas as r esponsab i l i dades re fe ren tes ao investigador, comitês de ética, assim como a criação do consentimento livre e esclarecido. Hoje, a Declaração de Helsinki constitui-se o documento universal de proteção aos voluntários. [1] [3] Em 1969 iniciou-se a utilização de estudos de bioequivalência, no Canadá, através de uma legislação para registro compulsório de medicamento. Em 1977 o FDA publicou diretrizes para a realização destes estudos. [5] Em virtude da expansão da pesquisa clinica e das indústrias farmacêuticas na evolução dos estudos in vitro e in vivo, a partir de 1970, começou a serem utilizados e desenvolvidos métodos de análise mais sensíveis, exatos e precisos para a determinação dos princípios ativos dos medicamentos, tanto em matrizes simples como em amostras biológicas, o que representou um avanço notável na quantificação dos processos de absorção e sua correlação com os fatores de formulação da dosagem adequada. [6] [7] Em 1989, foram iniciados no Brasil pelo Prof. Dr. Gilberto De Nucci na unidade de pesquisa de Farmacologia da Unicamp, os estudos de biodisponibilidade, ou seja, a taxa e a extensão que uma molécula após sua absorção torna-se disponível em seu sitio de ação, medindo-se a concentração do princípio ativo no sangue, soro ou outro fluido biológico, em função do tempo. Estes estudos foram incentivados com patrocínios de indústrias farmacêuticas em busca de garantir a qualidade e buscar marketing de seus medicamentos. [8] [9] Foi somente a partir de 1993 que ocorreu a primeira iniciativa legal a favor dos medicamentos genéricos no Brasil, já que somente o FDA e EMEA (Agência Européia d e M e d i c a m e n t o s ) p o s s u í a m regulamentação referente a estudos de biodisponibilidade/bioequivalência, pois até o momento não existia nenhuma regulamentação pela legislação brasileira. [8] A partir daí começaram a serem implantadas novas normas para condução dos estudos clínicos que apresentassem conformidade com os padrões éticos e científicos, implementando os comitês de ética em pesquisa (CEP e CONEP) e responsabi l idades por parte dos pesquisadores na condução dos estudos. [1] Em 1999, foi promulgada a lei 9.787 que estabeleceu diretrizes, normas e critérios para a implantação dos medicamentos genéricos no Brasil, ao mesmo tempo foi publicada uma resolução que estabelecia a regulamentação técnica para registros de medicamentos genéricos determinando que estes devem apresentar testes: in vitro (equivalência farmacêutica), in vivo – (biodisponibilidade relativa/bioequivalên- cia). [9] Os estudos de bioequivalência entre medicamentos tem como objetivo a comparação entre dois produtos (medicamento teste e medicamento referência) contendo o mesmo princípio ativo, na mesma concentração, mesma forma farmacêutica que, ao serem administrados na mesma dose molar, nas mesmas condições experimentais e pela mesma via. São avaliados parâmetros farmacocinéticos relacionados a 48 biodisponib i l idade, ou se ja , a quantidade absorvida e a velocidade do processo de absorção. Assim dois med icamentos são cons ide rados b i o e q u i v a l e n t e s q u a n d o e s t e s apresentarem mesma ou s imi la r disponibilidade segundo limites pré- estabelecidos. [10] Os estudos de bioequivalência de m e d i c a m e n t o s g e n é r i c o s d e v e m contemplar três etapas: clínica, analítica e estatística, as quais serão descritas posteriormente. 2- Etapa Clínica A etapa clínica compreende desde a seleção dos voluntários até a alta hospitalar e o último retorno para acompanhamento. Necessita seguir critérios regidos pelas Boas Práticas Clínicas, a qual expõe os critérios e padrões de qualidade para a estruturação, condução, relato e registro de todos os estudos realizados com humanos, a fim de garantir o bem estar, a ética e a credibilidade de acordo com os preceitos da Declaração de Helsinki. [11] Antes da execução da Etapa Clínica é necessária a elaboração e aprovação do protocolo de pesquisa para o estudo de bioequivalência. O protocolo de pesquisa é um documento que necessita ser aprovado por um Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) devidamente credenciado junto ao Comitê Nacional de Ética em Pesquisa (CONEP) sendo que, deve conter todas as informações referentes ao estudo a ser realizado. Entre estas citam-se: nome do fármaco, a dosagem, a forma farmacêutica, nome dos fabricantes dos medicamentos teste e de referência, local da pesquisa, responsabilidades do patrocinador do estudo, descrição detalhada do projeto de pesquisa, incluindo revisão bibliográfica dinâmica sobre a farmacocinética e farmacologia do medicamento, critérios de inclusão e exclusão de voluntários, duração do estudo, número de voluntários, delineamento, forma de confinamento, administração do medicamento, dieta, tempos de coleta , verificação de sinais vitais, o sistema de armazenamento e quantificação das amostras, parâmetros estatísticos utilizados, entre outras informações. O protocolo deve ainda apresentar termo de consentimento livre e esclarecido. Após sua elaboração, o mesmo é submetido para aprovação do CEP ou ainda pela ANVISA (Agencia Nacional de Vigilância Sanitária), sendo que após a aprovação pode ser inicializada a etapa clínica do estudo. [10] [11] [12] [13] A etapa clínica inicia-se a partir do recrutamento dos voluntários os quais são avaliados quanto aos critérios de inclusão e exclusão. São alguns dos critérios de inclusão: ter idade entre 18 e 60 anos, não apresentar nenhuma patologia, não tomar algum medicamento de uso contínuo, apresentar índice de massa corporal (IMC) dentro dos parâmetros normais, entre outros. Após esta primeira avaliação, estes voluntários são submetidos a consultas clínicas e exames laboratoriais para avaliação da aptidão na participação dos estudos. Os voluntários aptos são convidados a participar de determinado estudo, assinando um termo de consentimento livre e esclarecido e, se for de seu interesse é encaminhado a unidade para realização da etapa clínica, onde ficará confinado durante o período estimado no estudo. A área de confinamento deve apresentar instalações de segurança à realização dos procedimentos, tratamento de possíveis intercorrências (como situações de emergência) e conforto aos voluntários, além de supervisão médica durante todo o período do confinamento. [4] Os voluntários recebem os 49 m e d i c a m e n t o s c o n f o r m e o delineamento do estudo, juntamente com volume de líquido (geralmente água) padronizado. Após a administração do medicamento os voluntários sofrem coletas de sangue ou urina conforme tempos preconizados em protocolo e que compreendam o período de 3 a 5 meias vidas de eliminação do fármaco ou metabólito ativo. Caso o experimento envolva aplicação de outra dose do medicamento, o intervalo entre os períodos de administração deve compreender, pelo menos, sete meias- vidas de eliminação do fármaco ou do metabólito, quando o mesmo for ativo. A equipe médica deve preencher um formulário de registro de eventos adversos quando estes forem evidenciados e relacionar os procedimentos realizados para controle ou tratamento dos mesmos. [9] Após o término do estudo os voluntários recebem a alta da equipe médica, porém, estes realizarão uma nova avaliação (incluindo exames e avaliação médica) a fim de garantir a integridade da saúde dos mesmos. [12] As amostras coletadas são estocadas em congeladores com controle de temperatura em tempo integral e são encaminhadas a etapa analítica onde serão processadas para obtenção dos valores de concentração plasmática. [4] Todas as atividades realizadas nesta etapa necessitam ser documentadas em fichas clínicas, de confinamento e reações adversas e arquivadas por um tempo determinado para consulta, auditoria e outras avaliações efetuadas pelo órgão de fiscalização competente. [1] [4] 3 – Etapa Analítica Na etapa analítica os fármacos são quantificados, a partir das amostras coletadas durante a etapa clínica por um método bioanalítico. Os estudos de bioequivalência empregam a utilização de humanos, e os mesmos não podem ser envolvidos no estudo sem uma certeza que os fluídos biológicos obtidos serão devidamente analisados. Com isso, o método bioanalítico deve ser previamente validado [15]. A validação do método bioanalítico é um processo dinâmico e contínuo que inicia nas fases de seleção, desenvolvimento e otimização de metodologias, qualificação de equipamentos, materiais e pessoal. Um processo de validação bem definido e documentado fornece evidências objetivas de que o sistema e o método atendam as exigências das aplicações analíticas, sendo adequado para o uso pretendido. A validação é a execução de todos os parâmetros preconizados pelo órgão regulador, os quais são: Especificidade (HPLC) e Seletividade (LC-MS/MS), Linearidade, Precisão, Exatidão, Diluição, Limite de Quantificação (LQ), Limite de Detecção (LD exceto para sistema LC- MS/MS), Robustez e Estabilidade. [1] [15] Durante o desenvolvimento analítico, antes do início da validação do método, são definidas e testadas as concentrações da curva de calibração e as concentrações dos controles de qualidade (controle de qualidade baixo, médio e alto) utilizados como monitoramento das análises quanto a precisão e exatidão das análises, comparadas a uma curva de calibração. O estudo de estabilidade (parâmetro que faz parte da validação) visa determinar se o analito (princípio ativo ou metabólito) mantém-se quimicamente inalterado numa dada matriz biológica sob condições específicas, em determinados intervalos de tempo e tentam reproduzir as reais condições de manuseio e de análise das amostras biológicas. [1] Dentre os parâmetros utilizados na 50 sido demonstrar que, em média, a exposição na formulação teste está entre 20% da média da referência, na escala logarítmica, ou seja, A relação entre as distribuições Lognormal e Normal indica que, para variâncias iguais nas duas formulações, a razão de médias de lognormais é igual a diferença de médias de normais. Esse resultado vem da relação em que, é a média da variável logarítmizada (Normal). Assim, as hipóteses acima podem ser escritas como Assim, o intervalo (0,80; 1,25) define os limites de equivalência para a razão de médias de ASC e (-0,2231; 0,2231) para a diferença das médias na escala log. Os procedimentos para testar hipóteses relacionadas a diferenças de médias de populações normais são básicos (neste texto, apenas o caso de variâncias iguais será considerado). Para testar as hipóteses de interesse pode-se usar dois testes unilaterais de nível α (teste de Schuirmann), um para: e outro para Se é um estimador não ten- dencioso para , com um desvio padrão e seu estimador dado por (não tendencioso e com r graus de liber- dade), tem-se que segue a distribuição t com r graus de liberdade. Assim, é uma estatística de teste para as hipóteses em 1 ) e para as hipóteses em 2 ). Se ambas as hipóteses nulas são rejeitadas ao nível α, declara-se que as formulações são equivalentes. [16] Outra alternativa é a construção do intervalo de confiança 100(1-2α)% dado por: 4.3. Estimação Considerando o delineamento cruzado e Y ijk o log da ASC do i-ésimo indivíduo na k-ésima seqüência no j-ésimo período, pode-se associar o modelo: em que µ é a média geral; é o efeito aleatório do i-ésimo indivíduo na k-ésima seqüência (i =1, 2, ..., n e k =1 (TR), 2 (RT)); é o efeito fixo de k período, (j = 1, 2); é o efeito fixo da formu- lação e é o efeito residual da formulação ad- ministrada no período 1 sobre a resposta no período 2. O método da análise de variância é utilizado para estimar a contribuição de cada fonte de variação no modelo. ï ï î ï ï í ì << ³£ Þ ï ï î ï ï í ì 1,25 μ μ 0,80: 1,25 μ μ ou 0,80 μ μ : :H bioeq não : R T R T R T 0 A 0 AH H bioeq H RTiii ,),2/exp( 2 =+= shm ih ï î ï í ì <-<- ³-£- 0,22312231,0 :H 0,2231ou -0,2231:H RTA RTRT0 hh hhhh î í ì ->- £- 2231,0 :H -0,2231:H )1 RTA1 RT01 hh hh î í ì <- ³- 2231,0:H 0,2231:H )2 RTA2 RT02 hh hh D RT hh- Ds DSE D RT )( SE D t hh-- = D )2231,0( SE D t - = D 2231,0 SE D t - = .; ;; DrDr SEtDSEtD aa +- ijkikijk τ π ξ μ Y el+++++= k ikx p t kl 53 Tabela 1. Análise de Variância para um delineamento cruzado O QM é uma estimativa não I n t r a 2tendenciosa de σ . Através da estatística F pode-se testar se o efeito residual é significativo. Em caso de significância deste efeito, tem-se que o período de descanso não foi suficientemente longo. O órgão regulador requer justificativas para avaliar a aceitação do estudo. O efeito estimado de formulação é uma realização de , que, no caso de expe- rimentos balanceados, coincide com a diferença entre as médias observadas nas duas formulações. O erro padrão é obtido pela fórmula usual, usando o QM . Para Intra experimentos não balanceados, a es- timativa do efeito de formulação é obtido pela diferença entre as médias ajustadas (médias de mínimos quadrados). Essas estimativas são então usadas nos procedimentos de testes e construção de intervalos de confiança apresentados anteriormente. [1] [13] [16] 4.4. Tamanho das amostras Existem várias maneiras para se calcular o tamanho da amostra para estudos de bioequivalência, contudo em todos os casos é necessário informações sobre a variabilidade biológica do fármaco dentre outras informações. Um método muito utilizado que fornece um tamanho de amostra aproximado para experimento cruzado é baseado nos dois testes t unilaterais de Schuirmann. [17] [18] Este cálculo é obtido iterativamente, fixando-se o nível de significância, o poder do teste e o coeficiente de variação (CV) intra- individual. O CV é, em geral, obtido em estudos apresentados na literatura. Existem na literatura tabelas contendo tamanhos de amostra aproximados. [1] É de suma importância que o estudo tenha um número suficiente de voluntários, prevendo a existência de possíveis desistências durante a realização do experimento. O órgão regulador exige que o tamanho de amostra mínimo em estudos de bioequivalência seja 12 voluntários. [10] 5 – Referências bibliográficas [1] ANVISA. Manual de Boas Práticas em Biodisponibilidade: Bioequivalência. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Gerência-Geral de Inspeção e Controle de Medicamentos e Produtos. 2002. [2] MELO, D. O. RIBEIRO, E. ; STORPIRTIS, S. A Importância e a História dos Estudos de Utilização de Medicamentos. Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas. v. 42, n. 4, p. 475-485, out. 2006. [3] LUNA, F. 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Inter-individual Residual (sequencia) 1 SQResid QMResid Resíduos (inter) n1+n2-2 SQInte r QMInter Int ra-individual Formulação 1 SQForm QMForm Período 1 SQPer QMPer Resíduos (intra) n1+n2-2 SQInt ra QMIntra Total 2(n1+n2)-1 SQTota l Fonte g.l. SQ QM D 54 [12] ANVISA. Resolução nº196 de 10 de Outubro de1996. Estabelece os requisitos para a realização de pesquisa clínica em produtos para a saúde utilizando seres humanos. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. 2002. [13] PITTA, L. R. Estudo dos Métodos Estatísticos n a A n á l i s e d a B i o d i s p o n i b i l i d a d e Relativa/Bioequivalência para o registro de Medicamentos no Brasil. 2004. Dissertação de Mestrado. INCQS/FIOCRUZ. Rio de Janeiro. [14] OLIVEIRA, R. A. Métodos Estatísticos Aplicados a Bioequivalência Média. 2003. Instituto de Matemática, Estatística e Computação Científica, Universidade Estadual de Campinas, Campinas. o. [15] ANVISA. Resolução n 899 de 29 maio de 2003, Guia para Avaliação de Métodos Analíticos e Bioanalíticos. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. 2003. [16] HAUSCHKE, D.; STEINIJANS. V.; PIGEOT, I. Bioequivalence Studies in Drug Development: Methods and applications. John Wiley & Sons. Alemanha. 2007. [17] Chow, S. C.; Liu, J. P. Design and Analysis of aBioavailability and Bioequivalence Studies, 2 ed. Marcel Dekker, New York, 2000. [18] SCHUIRMANN, D. J. A Comparison of the Two One-sided Test Procedure and the Power Approach for Assessing the Equivalence of Average Bioavailability. Journal of Pharmacokin. Biopharm. v 17, 687-650, 1987. 55 discutida, em estudos de programação fetal, é como a memória dos eventos que ocorrem durante o desenvolvimento é armazenada e perpetuada ao longo da vida por meio da divisão e diferenciação celular [19]. Segundo Lucas [16], um ambiente nutricional prévio pode estimular a seleção clonal adaptativa ou proliferação e diferenciação celular de forma que a quantidade e proporção de células em um tecido são permanentemente afetadas. De fato, muitos trabalhos têm demonstrado os efeitos da programação gestacional sobre diversas vias moleculares, expressão gênica, tecido e órgãos. O que regularia, então, essas alterações? Segundo Young [20], os genes precisam de condições específicas para poderem ser expressos em proteínas fundamentais para o funcionamento do sistema biológico e que muitos genes nunca serão expressos porque nunca encontrarão condições adequadas de expressão. Dessa forma, a influência de fatores múltiplos no ambiente fetal poderia controlar a expressão dos genes nessa fase. A influência do ambiente na expressão do código genético é conhecida como epigenética [20]. M e c a n i s m o s e p i g e n é t i c o s c o m o modificação de histonas e metilação do DNA foram observados em filhotes em resposta a d i fe rentes condições gestacionais maternas [21]. 2 – Aspectos Epigenéticos Mecanismos epigenéticos como metilação do DNA e modificação de histonas são as chaves fundamentais na regulação da transcrição gênica, por meio do silenciamento e ativação dos genes [22]. Esses eventos são fundamentais para regulação da divisão e diferenciação celular no início do desenvolvimento fetal, uma vez que após fecundação inicia-se a divisão das células ainda indiferenciadas e que reguladas por proteínas e fatores transcricionais se tornarão células especializadas ou funcionais [22]. Essa fase do desenvolvimento é o momento mais delicado onde qualquer mecanismo agressor poderia estimular ou inibir vias celulares, fatores transcricionais e a expressão de proteínas. Todos esses eventos poderiam provocar alterações com repercussão no sistema biológico do indivíduo. De fato, inúmeros trabalhos têm demonstrado que estímulos como a influência da nutrição e da exposição ambiental a agentes tóxicos e ao estresse durante o período fetal e neonatal [23] p r o v o c a m m u d a n ç a s b i o l ó g i c a s significativas, desde mudanças na expressão gênica de proteínas essenciais como na morfofisiologia de tecidos e órgãos. 3 – Programação fetal e patologias associadas. O conceito de “programação fetal” sugere que o feto pode ser programado durante o desenvolvimento intra-uterino para desenvolver doenças na idade adulta [9; 24]. Este novo paradigma também sugere que a susceptibilidade a doenças, i nc lu indo doenças e d i s funções reprodutivas, é resultado da influência da nutrição e da exposição ambiental a agentes tóxicos e ao estresse durante o período fetal e neonatal [23]. FORSDAHL (1967) foi o primeiro autor a relacionar as condições dos primeiros anos de vida ao desenvolvimento de doenças na idade adulta [25]. Em seguida, uma série de investigações epidemiológicas demonstrou correlações entre a pressão sangüínea materna e de sua prole, sugerindo ser este um fator determinante. Vários modelos de subnutrição fetal foram desenvolvidos, nos quais o baixo peso da prole no nascimento era associado a elevação pressórica na 58 idade adulta [26; 27; 28; 29]. Posteriormente, BARKER (1998) mostrou a associação entre o peso ao nascer e o d e s e n v o l v i m e n t o d e d o e n ç a s cardiovasculares no adulto [30]. Outros estudos demonstraram relação direta entre o peso da criança ao nascer, o peso placentário e níveis pressóricos na idade adulta. Desta forma, indivíduos que apresentavam baixo peso ao nascer, associado a aumento no peso da placenta, quando adultos, desenvolviam pressão alta. Além disso, a pressão sistólica em crianças de 4 anos foi inversamente relacionada ao peso no nascimento e diretamente relacionada ao peso da placenta [31]. Desta forma, existe hoje ampla aceitação que tanto as fases gestacionais quanto os primeiros anos de vida são determinantes no desenvo lv imento de doenças metabólicas e cardiovasculares na idade adulta [32]. Em 1999 LANGLEY-EVANS et al estabeleceram que a prole de ratas prenhas submetidas à dieta isocalórica com moderada restrição protéica, apresentava menor massa renal indicando efeito específico da restrição protéica na ontogênese [33]. Ratos neonatos apresentavam menor número de glomérulos maduros e tal diminuição persistia nas quatro primeiras semanas de vida mesmo se recebessem alimentação normal. Desta forma, a redução no número de néfrons e/ou na superfície de filtração glomerular poderia resultar em menor excreção urinária de sódio, aumento da pressão arterial sistêmica, hipertensão glomerular e nefroesclerose progressiva que perpetuaria a situação hipertensiva. Hoje várias evidências indicam que tanto os rins quanto o sistema nervoso central são vulneráveis a diversas influências em estágios de desenvolvimento embrionário [34]. As alterações, em resposta ao insulto gestacional, são detectadas nas primeiras etapas do desenvolvimento embrionário. Um trabalho com ratos mostra que restrição nutricional materna, durante período de pré implantação, causa anormalidades no blastocisto e programa o animal para hipertensão pós natal [35]. Sob essa mesma condição, o rato também apresenta restrição no crescimento intrauterino e essa resposta pode estar associada à expressão prejudicada de GLUT-3 placentário [36]. O comportamento também é afetado na programação gestacional. Determinados testes demonstram que a restrição protéica na fase gestacional pode alterar o comportamento exploratório em fêmeas [37], bem como alterar interação social em ratos jovens [38]. De acordo com Massaro e equipe [39], a restrição é capaz de alterar o c o m p o r t a m e n t o m a t e r n o e o desenvolvimento dos filhotes. Em termos morfofuncionais, foi observado que dieta com baixo teor de proteína durante gestação afeta o desenvolvimento cerebral em ratos [40], bem como o metabolismo de gordura e taxa de crescimento [41]. Além disso, que a exposição à desnutrição fetal determina a distribuição de gordura corporal, atividade locomotora e consumo alimentar em ratos adultos [42] e que distúrbios na homeostase do colesterol tem origem intra-uterina [43]. Existem evidências experimentais sugerindo que a restrição protéica gestacional leva à expressão aumentada de a lguns receptores hormonais na prole [44]. A desnutrição, quando imposta no período fetal, pode predispor o indivíduo adulto a doenças cardiovasculares e diabetes tipo II, ou mesmo a fatores que estão assoc iados à h iper tensão, intolerância a glicose e hiperlipidemia [10; 11; 12; 13; 14; 15]. 59 As respostas ou mecanismos biológicos que o r ien tam e/ou provocam a programação gestacional ainda são pouco explorados. Um conjunto de técnicas histológicas, morfométricas, citoquímicas, imunocitoquímicas, bioquímicas, ultra- estruturais e da expressão gênica devem ser alocadas para melhor explicar esse fenômeno de importância mundial. 4- Referências bibliográficas [1] - LUCAS, A. programming in early nutrition in man. Ciba Foun Symp, v. 156, p. 38-53, 1991. [2] - ONIS, M.; BLÖSSNER, M.; BORGHI, E.; FRONGILLO, E.; MORRIS, R. Estimates of Global Prevalence of Childhood Underweight in 1990 and 2015. JAMA, 2912600-2606, 2004. [3] - KINGDOM, J.C.P.; BURREL, S.J.; KAUFMANN, P. 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N a a d n a ç ã o , e x i s t e concrescimento entre peças florais de verticilos diferentes, como estames e pétalas. Na conação, o conscrescimento ocorre entre peças do mesmo verticilo floral. Algumas flores apresentam ginóforo e andróforo, que são estruturas que elevam o gineceu e o androceu respectivamente. Quando gineceu e androceu são elevados pela mesma estrutura, esta é denominada androginóforo. As flores podem apresentar todos os verticilos florais (flores completas), mas um ou mais verticilos podem estar ausentes (flores incompletas). Se a flor apresentar cálice e corola, ela é chamada diclamídea, podendo ser homoclamídea (cálice e corola idênticos) ou heteroclamídea (cálice e corola distintos); se apresentar apenas o cálice ou a corola é dita monoclamídea; e, se não possuir nenhum verticilo estéril, é denominada aclamídea. As flores podem ser hermafroditas (flores bissexuais com gineceu e androceu funcionais), masculinas ou estaminadas (flores unissexuais, apresentando apenas androceu) e femininas ou pistiladas (flores unissexuais compostas apenas por gineceu). Quanto à expressão do sexo na planta, ela pode ser hermafrodita (plantas unicamente com flores hermafroditas), monóica (flores masculinas e femininas distribuídas na mesma planta ou indivíduo), andróica ou masculina (planta com flores masculinas apenas), ginóica ou feminina (planta apenas com flores femininas), andromonóica (planta com flores hermafroditas e masculinas), ginomonóica (planta com flores hermafroditas e femininas) e trimonóica (planta com os três tipos de flores). Na natureza podemos encontrar diferenças na expressão do sexo dentro das populações de p lantas. Espécies hermafroditas são aquelas formadas apenas por plantas hermafroditas. Espécies monóicas consistem apenas de plantas monóicas. Espécies dióicas são as que apresentam plantas unissexuais femininas e unissexuais masculinas. Espécies androdió icas apresentam plantas hermafroditas e plantas masculinas. E espécies ginodióicas são as constituídas por plantas hermafroditas e femininas. Outras combinações também ocorrem na natureza, mas são mais raras. Cerca de 80% das plantas é hermafrodita e, apenas 10% apresentam indivíduos com sexos separados. 3 - Síndromes de Polinização A polinização é o principal evento que ocorre na vida das flores. Consiste no transporte do grão de pólen das anteras de uma flor até o estigma da mesma ou de outra flor. Nas angiospermas, acontece sob grande variedade de formas, podendo demonstrar alto grau de especialização e 63 adaptação. Os agentes polinizadores podem ser abióticos ou bióticos. Os agentes abióticos são o vento (anemofilia) e a água (hidrofilia). Nesses casos de polinização, as flores apresentam adaptações que favorecem a polinização por aquele determinado agente. Os agentes bióticos são os animais (zoofilia) como, insetos (entomofilia), aves (ornitofilia) ou mamíferos. Entre os insetos, os polinizadores mais comuns são os besouros (cantarofilia), as moscas (miofilia), as abelhas (melitofilia), as borboletas (psicofilia), as mariposas (falenofilia) e as vespas. Dentre os mamíferos, os morcegos (quiropterofilia) são os agentes mais comuns, mas existem mamíferos não voadores que também podem realizar a polinização (terofilia). Em cada um desses casos, podemos observar co-adaptações entre as plantas e os agentes polinizadores. Isto é, existe uma correspondência entre o tamanho, a forma, a cor, o odor da flor e os tipos de polinizadores. Desta forma, é possível identificar um conjunto de características florais que constituem a “preferência” de cada polinizador, garantindo a visita deste, a chamada de síndrome de polinização. A entomofilia foi extremamente importante para o sucesso evolutivo das angiospermas, pois permitiu uma maior eficiência na polinização sobre condições ambientais variadas além de um maior potencial na polinização cruzada. As maiores famílias de angiospermas apresentam grande diversidade de polinizações entomófilas, com exceção de Poaceae que tem como principal a polinização anemófila. No caso da polinização realizada por animais, a relação flor-visitante deve ser estabelecida por meio de um atrativo que, para ser efetivo, deve desencadear no visitante uma reação que incita ou satisfaz necessidades básicas como alimento, abrigo, proteção e local para o acasalamento. Existem dois tipos de atrativos florais, os primários e os secundários. Os atrativos primários são aqueles que satisfazem diretamente as necessidades básicas dos animais, como pólen, néctar, óleos, tecidos florais, dentre outros. Os atrativos secundários são os que apenas iniciam uma reação direta ou indireta ao nível do aparato sensorial do animal, como odor, forma, cor, temperatura, dentre outros. Existem vários tipos de flores, de acordo com a forma e o acesso aos recursos (néctar, pólen, tecidos florais, dentre outros). Flores com acesso livre aos recursos podem ser: flores abertas, em forma de disco ou prato (o que permite que qualquer animal as visitem); flores abertas, do tipo escova, com grande quantidade de estames (o que faz a atração dos polinizadores); e flores abertas, pendentes, com perianto reflexo (nesse caso, os animais tem que pairar no ar para obter os recursos florais, portanto, animais que pousam não conseguem visitar essas flores). Flores com acesso restrito aos polinizadores podem ser: flores tubulares (que formam um tubo que restringe o acesso ao néctar); flores em forma de bandeja (apresentam uma superfície de pouso para os animais e um tubo com o néctar no fundo, restringindo o seu acesso); flores com espora ou cálcar (o néctar fica retido no fundo do cálcar por capilaridade, restringindo esse recurso aos polinizadores de aparato bucal correspondente à profundidade do cálcar); flores com anteras tubulares (o polinizador tem de fazer movimentos vibratórios para que o pólen seja liberado, são anteras poricidas e os polinizadores, geralmente, são abelhas); 64 flores com estigma côncavo (comum em orquídeas, pois há o concrescimento do gineceu e do androceu); flores com vários acessos ao néctar (os animais têm de ficar circundando a flor para obter o recurso em todos os seus acessos, assim, conseguem entrar em contato com grande quantidade de pólen); flores com néctar disposto c i r cu la rmente (maracu já ) ; f l o res papilionadas (o pólen fica protegido pela quílea e o néctar fica no fundo); flores bilabiadas (a corola se abre como uma boca na extremidade); flores armadilha (o animal entra e fica preso na flor por um tempo suficiente para que a polinização ocorra, depois são liberados, embora muitos não consigam mais sair e morrem). Além disso, as flores podem ser classificadas quanto ao local que o pólen gruda no corpo do polinizador. Nas flores esternotríbicas, o pólen gruda na parte ventral do corpo do agente polinizador. Nas flores nototríbicas, o pólen é depositado na parte dorsal do corpo do animal. E, nas flores pleurotríbicas, o pólen gruda nas partes laterais do corpo do polinizador. As flores podem ser efêmeras, quando se abrem apenas em um período e fecham noutro, ou pers istentes, quando permanecem abertas mesmo após a fase funcional. Os an imais podem apresentar comportamento especializado, quando só visitam um determinado tipo de flor, ou comportamento generalizado, quando visitam muitos tipos florais. A s f l o r e s p o d e m a p r e s e n t a r especializações que permitem que apenas um único animal faça a polinização ou podem não apresentar especializações, sendo visitadas por uma ampla variedade de animais. 4 - Principais características das diferentes classes de flores quanto à polinização Flores anemófilas (vento): flores reduzidas, não vistosas, podendo estar reunidas em inflorescências; antese diurna; pólen farináceo (grãos de pólen pequenos, lisos e secos) e produzido em grande quantidade; superfície estigmática grande (aumenta a probabilidade de captação do pólen); ausência de néctar. Flores melitófilas (abelhas): antese diurna; cores vivas (geralmente branco, amarelo ou azul); presença de guias de néctar; odores frescos, geralmente não muito fortes; superfícies adequadas para o pouso dos visitantes (plataforma de pouso). Flores psicófilas (borboletas): flores eretas, radiais e com anteras fixas; extremidades florais com poucos recortes; antese diurna; odor fraco, geralmente agradável; coloração viva como amarelo, vermelho e azul; néctar relativamente abundante e incluso em tubos ou esporas. Flores falenófilas (mariposas): flores brancas, pardas ou descoradas, com lobos profundamente recortados; antese noturna; odores fortes e doces, emitidos apenas durante a noite; flores horizontais ou pendentes; néctar relativamente abundante e localizado em longos tubos ou esporas. Flores miófilas (Diptera): antese diurna; flores regulares, simples, de cores geralmente claras, mas pálidas; odor imperceptível; presença de guias de néctar; néctar exposto e de fácil acesso; órgãos reprodutivos florais bem expostos. Flores sapromiófilas (moscas): flores com profundidade, com guias para armadilhas; cores opacas, escuras, do marrom ao púrpura, com manchas escuras; presença de janelas transparentes; odores desagradáveis, semelhantes ao odor de 65 das famílias Nitidulidae, Staphylinidae, Chrysomelidae e tripes [5; 6]. Os principais polinizadores são os coleópteros de diferentes famílias, que são atraídos até as flores na fase em que os estigmas estão receptivos (fase pistilada ou feminina) e permanecem no interior da “câmara de polinização” alimentando-se de pétalas e utilizando as flores como local de acasalamento. Quando o pólen é liberado, os insetos entram em contato com este, ficando aptos a transportá-lo para outras flores receptivas. Terminada a liberação do pólen, as pétalas caem, obrigando os insetos a voarem; nesta ocasião, flores na fase pistilada liberam odores que irão atrair os insetos, efetivando-se a polinização [5; 6; 10]. As espécies polinizadas por besouros, normalmente apresentam flores pêndulas ou inclinadas, amarelas, verdes ou avermelhadas e produzem um forte e desagradável odor apimentado de fruta. Um dos mais interessantes caracteres florais é a câmara de polinização, formada, como dito anteriormente, pelas pétalas internas que se fecham sobre o centro da flor durante a antese. Nesta câmara floral, odores específicos são produzidos para atrair os besouros, que encontram um ambiente aquecido, repleto de alimento (tecidos do perianto e pólen); insetos de ambos os sexos para a cópula, além de encontrarem abrigo e proteção contra a luz solar e predadores, como destacado por Ratnayake et al. [12]. O tamanho da câmara, a quantidade de alimento disponível e a e s p e s s u r a d a s p é t a l a s e s t ã o correlacionados com o tamanho, o número e a voracidade dos besouros associados. Considera-se que a função primária dessa restrição é selecionar e limitar os besouros visitantes, protegendo os órgãos reprodutivos [5; 6;10]. Muitas espécies apresentam termogênese que pode atingir até 12ºC acima da temperatura ambiente, o que aumenta a liberação dos compostos odoríferos [2; 5]. De acordo com Judd et al. [3], as flores de Annonaceae apresentam especializações aos polinizadores, incluindo flores relativamente fechadas, tecidos comestíveis, odores, pétalas carnosas e espessas, e estruturas protetoras dos órgãos reprodutivos. Gottsberger & Silberbauer-Gottsberger [5] relataram, para espécies polinizadas por g r a n d e s b e s o u r o s , e s t r u t u r a s especializadas na superfície adaxial ou nas margens das pétalas internas, que são ingeridas pelos besouros visitantes; segundo os autores, podem ser formados corpos de alimentação e tecidos nutritivos, que apresentam células ricas em amido, lipídios, taninos e mucilagem, embora nem todas essas substâncias estejam, necessariamente, presentes ao mesmo tempo. Aparentemente, esse é o único alimento disponível para os besouros no estágio inicial da fase pistilada, pois o pólen é liberado e pode ser consumido apenas na fase estaminada, que é posterior. Amido e lipídios nas pétalas, além de serem alimentos para os besouros, comumente apresentam importante papel durante a termogênese, em que a degradação de carboidratos e lipídios promove a liberação de calor. Thien et al. [13] já destacaram que as fragrâncias f lorais e o calor desempenham importantes papéis nos sistemas reprodutivos das angiospermas basais, em que os odores podem sinalizar, não apenas o alimento e local para reprodução, mas também a fonte de calor. 6 – Biologia Floral e polinização em Myrtaceae As Myrtaceae são tradicionalmente divididas em duas subfamílias: Myrtoideae, que possui frutos carnosos e distribui-se 68 em partes tropicais e subtropicais do globo terrestre, particularmente América do Sul [14] e trópicos do Velho Mundo [15], e Leptospermoideae, com frutos secos, limitada, com exceção da subtribo Metrosiderinae, à Austrália [15]. Myrtoideae é constituída por 60 gêneros e 2.375 espécies, e Leptospermoideae, por 72 gêneros e 1.300 espécies [16]. Pesquisas indicam a presença de vários tipos de sistemas de reprodução em Myrtaceae [16]. O tipo de dicogamia presente na grande maioria das espécies hermafroditas de Myrtaceae é a protandria [16; 17]. Em espécies de Leptospermoideae, as flores apresentam intervalos de dias, e até semanas, separando claramente as fases masculina e feminina [17]. Em Myrtoideae, a dicogamia não é facilmente detectada, porque várias espécies desta subfamília apresentam flores de vida curta, nas quais, inclusive, pode haver sobreposição de fases femininas e masculinas, fornecendo, assim, potencial para auto-polinização. Entretanto, parece improvável que a separação temporal de fases femininas e masculinas seja difundida, porém indetectável, em Myrtoideae com flores de vida curta, embora este fenômeno ainda seja pouco reportado [16]. O gênero Myrcianthes é a única referência confiável de protandria em Myrtoideae [16]. Em algumas espécies deste gênero, o estigma permanece curvado até a liberação da maior parte do pólen por fendas longitudinais direcionadas para fora; só então, o estigma torna-se ereto e aparentemente receptivo. Em Myrciaria dubia (Myrtoideae), é reportada a presença de protoginia [16], pois o estigma exibe-se primeiro e os filetes das numerosas anteras expandem- se depois; a antese ocorre pela manhã e as flores são receptivas por 4-5 horas, sendo que, quando as anteras liberam pólen, o estigma não está mais receptivo. A andromonoicia é comum em Leptospermoideae [17], porém ainda não detectada em Myrtoideae [16]. A dioicia clássica é pouco reportada em Myrtaceae, embora provavelmente ocorra [16]. Em Leptospermoideae, dioicia não tem sido encontrada, e aparentemente limita-se ao pequeno gênero Carpolepsis, restrito à Nova Caledônia (ilhas no sul do Oceano Pacífico). Em Myrtoideae, este fenômeno também parece estar restrito às espécies da Nova Caledônia. Os atrativos visuais são os mais conspícuos nas flores de Myrtaceae. São eles as pétalas e/ou os estames [17], sendo estes numerosos e de coloração contrastante com o restante da flor. A recompensa da maioria das Myrtoideae é o grão de pólen, nos quais há lipídeos e açúcares, tornando-os interessantes aos visitantes [17]. Em Leptospermoideae, a produção de néctar é difundida [18]. Em Myrtoideae, apenas algumas espécies apresentam pequenas quantidades de néctar, que, quando presentes, são a principal recompensa dos visitantes. Uma outra recompensa possível é o fluído secretado pela cavidade secretora do ápice do conectivo da antera. Tal fluído é ricamente lipídico e solidifica-se, podendo servir como recurso alimentar para insetos polinizadores. Tal função já foi constatada em Leptospermoideae, porém é pouco estudada em Myrtoideae [16]. Apoidea são os polinizadores mais comuns de Myrtaceae. Há, também, uma forte associação entre Myrtaceae e Colletidae, que são consideradas as mais primitivas abelhas visitantes de flor; tal relação é mais comum na Austrália, onde 69 metade das espécies de abelhas pertence a Colletidae, mas provavelmente também ocorra nos Neo-trópicos. O comportamento das abelhas durante a polinização é variável. A polinização por vibração (“buzz-pollination”) foi reportada para algumas espécies [16]. Polinização sem vibração ocorre em várias espécies, como Campomanes ia pubescens , Campomanes ia ve lut ina , Eugenia dysenterica, Myrcia linearifolia, Psidium firmum e Plinia glomerata polinizadas por Bombus spp. A polinização por pássaros é menos freqüente em Myrtoideae que em Leptospermoideae [16]. Pássaros são os visitantes vertebrados mais comumente observados em Syzygium cormiflorum e S. tierneyanum na Austrália e sugeriu-se que e les sejam os mais importantes polinizadores. Beardsell et al. [17] declararam que o florescimento caulifloro de várias espécies de Syzygium poderia facilitar o acesso às flores por grandes marsupiais, que sobem e descem os caules (em Leptospermoideae), e que morcegos (noturnos e não facilmente estudados), poderiam ser os mais importantes polinizadores de algumas Myrtaceae. Muitas especulações foram feitas inicialmente com relação à polinização anemófila, embora nenhuma tenha sido confirmada. Foram inicialmente citadas como anemófilas Myrciaria dubia, Acca sellowiana, entre outras, embora outros estudos contradigam esta afirmação. 7 – Referências Bibliográficas [1] SOUZA, V.C.; LORENZI, H. Botânica Sistemática: guia ilustrado para identificação das famílias de Angiospermas da flora brasileira, baseado em APG II. Nova Odessa: Instituto Plantarum, 2005. p.82-85. [2] RIBEIRO, J.E.L.S.; HOPKINS, M.J.G.; VICENTINI, A.; SOTHERS, C.A.; COSTA, M.A.S.; BRITO, J.M.; SOUZA, M.A.D.; MARTINS, L.H.P.; LOHMANN, L.G.; ASSUNÇÃO, P.A.C.L.; PEREIRA, E.C.; SILVA, C.F.; MESQUITA, M.R.; PROCÓPIO, L.C. Flora da Reserva Ducke: guia de identificação das plantas vasculares de uma floresta de terra-firme na Amazônia Central. Manaus: Inpa. 1999. [3] JUDD, W.S.; CAMPBELL, C.S.; KELLOG, E.A.; STEVENS, P.F. Plant Systematics: a phylogenetic approach. Massachusetts: Sinauer Associates. 1999. [4] PONTES, A.F.; BARBOSA, M.R.V.; MAAS, P.J.M. Flora Paraibana: Annonaceae Juss. Acta Bot. Bras., v.18, n.2, p.281-293, 2004. [ 5 ] G O T T S B E R G E R , G . ; S I L B E R B A U E R - GOTTSBERGER, I. In the evening when the beetles come: Pollination in Annonaceae e Philodendron. In: EDITORES. (Eds.). Life in the Cerrado: a South American Tropical Seasonal Vegetation. Local> Editora, 2006. v.2. p.138-159. [6] GOTTSBERGER, G. As Anonáceas do cerrado e sua polinização. Rev. Bras. Biol., v.54, p.391-402, 1994. [7] MAAS, P.J.M.; WESTRA, L.Y.Th.; CHATROU, L.W. Duguetia (Annonaceae). Flora neotropica, v.88, p.1- 274, 2003. [8] BRIECHLE-MÄCK, M. Aspects of floral ontogeny and comparative anatomy of gynoecium and fruit in the genera Annona and Rollinia. Annonaceae Newsletter, v.9, p.48-50, 1993. [9] SETTEN, K. van; KOEK-NOORMAN, J. Fruits and seeds of Annonaceae. Morphology and its significance for classification and identification. Bibl. Bot., v.142, p.1-101, 1992. [ 1 0 ] S I L B E R B A U E R - G O T T S B E R G E R , I . ; GOTTSBERGER, G.; WEBBER, A.C. Morphological and functional flower characteristics of New and Old World Annonaceae with respect to their mode of pollination. Taxon, v.52, p.701-718, 2003. [11] CARVALHO, R.; WEBBER, A.C. Biologia floral de Unonopsis guatterioides (A.D.C.) R.E. Fr., uma Annonaceae polinizada por Euglossini. Rev. Bras. Bot., v.23, n.4, p.421-425, 2000. [12] RATNAYAKE, R.M.C.S.; GUNATILLEKE, I.A.U.N.; WIJESUNDARA, D.S.A.; SAUNDERS, R.M.K. Pollination ecology and breeding system of Xylopia championii (Annonaceae): Curculionid beetle pollination, promoted by floral scents and elevated floral temperatures. Inter. J. Plant Sci., v.168, p.1255-1268, 2007. [13] THIEN, L.B.; AZUMA, H.; KAWANO, S. New perspectives on the pollination biology of basal angiosperms. Inter. J. Plant Sci., v.161, p. S225-S235, 2000. [14] RYE, B.L.; JAMES, S.H. The relationship between dysploidy and reproductive capacity in Myrtaceae. Austr. J. Bot., v.40, p.829-848, 1992. [15] SCHMID, R. Comparative anatomy and morphology of Psiloxylon e Heteropyxis, and the subfamilial and tribal classification of Myrtaceae. Taxon, v.29, p.559-595, 1980. [16] NIC LUGHADHA, E.; PROENÇA, C. A survey of the reproductive biology of the Myrtoideae (Myrtaceae). Ann. Miss. Bot. Gard., v.83, p.480-503, 1996. [17] BEARDSELL, D.V.; O'BRIEN, S.P.; WILLIAMS, E.G.; KNOX, R.B.; CALDER, D.M. Reproductive biology of australian Myrtaceae. Austr. J. Bot., v.41, p.511- 526,1993. 70 Tabela 2: Classificação dos praguicidas segundo sua dose letal. CATEGORIA DL (mg/kg) 50 Extremamente tóxico ≤ 1 Altamente tóxico 1 - 50 Moderadamente tóxico 5 - 500 Ligeiramente tóxico 500 - 5000 Praticamente não tóxico 5000 - 15000 Relativamente inofensivo ≥ 15000 Outra classificação bastante utilizada, principalmente para os praguicidas de uso doméstico, é a por tarja de cores, onde o vermelho significa extremamente tóxico, o amarelo altamente tóxico, o azul medianamente tóxico e o verde pouco tóxico. A fase cinética de interação com o organismo é muito importante, pois após a exposição, nesta fase são determinados os fatores que permitem a interação ou não do toxicante com a molécula alvo ou receptora e as alterações conseqüentes a que chamamos de intoxicação, onde são observados os sinais e sintomas clínicos. Aqui, é de suma importância o papel do fígado como órgão metabolizador. Pa r t i cu l a rmen te t r ê s f enômenos importantes estão envolvidos neste processo [2]: a eliminação metabólica, que diminui bastante a probabilidade de intoxicação por via alimentar; o fenômeno da indução enzimát ica hepát ica , responsável pela ativação do metabolismo e relacionada à resistência nos organismo alvos e não alvos; e o fenômeno da inibição enzimática hepática, relacionado à interação entre toxicantes, com o perigo inclusive de potenciação da resposta tóxica. 2.4 - Classificação química, mecanismos de ação tóxica e efeitos dos principais grupos de praguicidas e os tratamentos preconizados [1;3]: 2.4.1- Inseticidas Quimicamente podem ser divididos em: A- Inseticidas organo-clorados A.1- derivados do cloro-benzeno: DDT, DDE, dicofol, pertane, metoxiclor, metoclor, anofex, diclorfano, gesapon etc... A.2 - der i vados do benzeno e ciclohexanos clorados: HCE, HCH, lindade (gama BHC) etc... A.3- derivados policíclicos clorados: aldrin, endrin, dieldrin, heptacloro, c l o r d a n o , m i r e x , e n d o s s u l f a n , clordecone etc... A.4- derivados canfenos clorados: toxafeno, estrobano etc... Os organo-clorados tipo DDT e análogos prolongam o tempo de abertura de canais de sódio; já os do grupo do lindane, toxafeno e os ciclodienos, inibem o fluxo de cloro regulado pelo GABA (inibidores competitivos); os organo-clorados também interferem com o cálcio celular, por modificarem a atividade da enzima ++ ++Ca /Mg ATPase de membrana e com a calmodulina. Além destas ações, produzem efeito de bioacumulação no oraganismo, e alguns, são potentes indutores enzimáticos hepáticos. Os sinais e sintomas clínicos de intoxicação mais evidentes são [1;2]: - distúrbios neurológicos: parestesias da língua, face e lábios; apreensão, hiperexcitabilidade a estímulos, tonturas, distúrbios do equilíbrio (marcha), tremores, fibrilações e espasmos musculares, mioclonias, convulsões tônico-clônicas, confusão mental, coma; - ansiedade, alterações no EEG, artralgia, perda de memória; - vômito, cólicas abdominais, diarréia, salivação, dor retroexternal (mais evidente em casos de ingestão); - estimulação enzimática hepática (crônica); - carcinogênese (DDT, aldrin, heptaclor); - mutagênese (aldrin); - perda de peso, anorexia, anemia, tremores; 73 - sobre reprodução: diminuição drástica da espermatogênese. O tratamento do envenenamento por organo-clorados é sintomático, uma vez que neste caso não existe antídoto específico. Nas intoxicações, é possível controlar o estado convulsivo com barbitúricos (gardenal) em casos mais graves ou benzodiazepínicos (diazepan) quando forem moderadas ou leves. B- Inseticidas organo-fosforados e carbamatos Os organo-fosforados são derivados químicos do ácido fosfórico e seus congêneres (tiofosfórico e pirofosfórico) [1;3;4]. Exemplos: malation, paration (etílico e metílico), diazinon, fention, etion, DDVP (diclorvós), clorpirifós, dimetoato, metamidofós, folidol, azodrin, nuvacron, tamaron etc... Os carbamatos são derivados químicos do ácido N-metilcarbâmico. Exemplos: carbaril, carbofuran, temik, metiocarb, furadan, sevin, propoxur etc… A m b o s , o r g a n o - f o s f o r a d o s e carbamatos, são inibidores da colinesterase (acetil, butiril) sanguínea incapacitando a mesma de exercer sua função, ou seja, desdobrar a acetilcolina circulante em colina e ácido acético. Por se ligarem predominantemente ao centro esterásico da enzima, os organo-fosforados são inibidores irreversíveis, enquanto que os carbamatos são reversíveis. Os sinais e sintomas clínicos de intoxicação são derivados da crise colinérgica resultante: - sialoréia, lacrimejamento, náusea, vômito, diarréia, aumento de secreção brônquica; - bradicardia, sudorese, fasciculação, tremores musculares, dispnéia, depressão respiratória; - miose, hiperatividade, convulsões, coma e morte; - inibição tardia da esterase neurotóxica (ataxia, paralisias de braços e pernas e parestesias). A avaliação da intoxicação pode ser feita pela dosagem da atividade da enzima colinesterase sanguínea sobre seu substrato acetilcolina [4]. Para atividade entre 20 e 90%, sugere-se afastar o indivíduo da fonte de exposição e desenvolver medidas sintomáticas; entre 10 e 20%, sugere-se que seja feito antidotismo severo, medidas gerais e sintomáticas. O antidotismo é feito à base de atropina (bloquear no receptor da acetilcolina) e pralidoxima (contration) (reverter a ligação do organo-fosforado à enzima liberando-a para novamente atuar sobre a acetilcolina). C- Inseticidas piretróides Este é um grupo de toxicantes que é bastante utilizado em vários níveis: - Agricultura – nas lavouras de algodão, café, laranja, maça, figo, cebola, tomate, arroz, fumo e em grãos armazenados e silos. (cipermetrina, deltametrina, permetrina); - Veterinária – como acaricida, bernicida, ovicida, mosca do chifre (flumetrina, deltametrina, permetrina, cialotrina); - Campanhas de Saúde Púlbica – dengue, dedetizações (cipermetrina; - Uso doméstico – estermínio de pernilongos, baratas, etc. (permetrina, tetrametrina, ciflutrina, deltametrina); - Escabiose e Pediculose (deltametrina e permetrina). Os inseticidas piretróides possuem em sua molécula uma estrutura básica composta por um álcool, um éster e um ácido. Os compostos de origem natural são piretrinas, jasmolinas e cinerinas os quais foram extraídos, originariamente, do crisântemo e possuíam baixo poder de toxicidade. Os inseticidas piretróides hoje 74 utilizados são derivados sintéticos e possuem maior grau de toxicidade. Quimicamente podem ser divididos em piretróides do tipo I e do tipo II. A diferença entre os dois grupos é que o tipo II possui -um radical alfaciano (CN ) na molécula. Isto faz com a relação estrutura/atividade seja alterada, incluindo a metabolização, meia- vida e toxicidade destes compostos. Seu mecanismo de ação tóxica ocorre por inibição do fluxo de cloro regulado pelo GABA (funcionam, à semelhança dos inseticidas organo-clorados, como inibidores competitivos do GABA); também interferem com o cálcio celular, provavelmente por modificarem a atividade ++ ++da enzima Ca /Mg ATPase de membrana, que faz a extrusão do cálcio celular [1;3;6]. Os piretróides do tipo I provocam uma s índrome chamada s índrome “T” caracterizada por tremores involuntários; os do tipo II, provocam uma síndrome chamada síndrome “CS”, caracterizada por coreoatetose e salivação. De modo geral o efeito tóxico mais proeminente e danoso é a neurotoxicidade excitatória, a qual inclui o sistema cerebral, medula espinhal e elementos do sistema periférico (gerando dificuldades de locomoção). Os sinais e sintomas clínicos mais comuns da intoxicação por piretróides são: - Cutâneos: parestesia (ação direta nos nervos sensoriais periféricos), dormência, coceira, ardência ou formigamento da pele (provoca insensibilidade da pele). Dermatite alérgica, erupção com prurido, urticária na face, braços, troncos e pernas. - Olhos: dor, lacrimejamento, fotofobia, congestão, edema da conjuntiva, lesão da córnea. - Ingestão: dor epigástrica, náusea, vômitos prolongados com cólicas e diarréia. Convulsões, coma e morte por paralisia respiratória. Não existem antídotos específicos para os inseticidas piretróides. O tratamento é sintomático e segue a mesma linha do tratamento feito para os organo-clorados, já que o mecanismo é muito semelhante. D- Inseticidas fumigantes São toxicantes utilizados na forma de gases, para controle de pragas de silos e sacarias. O mais utilizado é o fosfeto de alumínio, cuja exposição, por sua natureza gasosa, ocorre por via pulmonar [1]. Os sintomas clínicos apresentados quando há intoxicação por este grupo de agentes são: náuseas, vômito, cefaléia, irritação pulmonar (gera dispnéia), fadiga, icterícia, convulsão, coma e morte. O tratamento é sintomático e medidas de suporte, pois não existe antídoto específico. Uso da associação de agentes As finalidades do uso em associação seriam principalmente duas: - diminuir o espectro de toxicidade; - manter/aumentar a eficácia tóxica. Um exemplo destas associações é o produto Ectoplus® utilizado em veterinária, que é uma associação entre o organo- fosforado DDVP (também conhecido como diclorvós) e o piretróide cipermetrina. Resistência aos inseticidas Responsável pela diminuição da eficácia nos insetos. Ocorre devido a uma diversificação que ocorre nas isoenzimas do citocromo P450, que fazem a metabolização dos inseticidas. Demonstra a importância do fígado como órgão metabolizador implicado neste processo [2]. 2.4.2 – Herbicidas As substâncias deste grupo são bastante utilizadas em agricultura para o controle de ervas daninhas, como reguladores do 75 cartuchos, revestimentos protetores contra radiações X, vidros cristais, cerâmica v i t r i f icada, br inquedos, c igarros, metalurgia, fundição, alimentos enlatados, p ragu i c idas , j o rna i s , l aminação , esmaltação, raspagem, óleos lubrificantes e na gasolina de automóveis, como aditivo anti-detonante (Pb-tetraetila e Pb- tetrapropila - 0,74 g/L). Há presença também na própria alimentação, ou manuseio de tintas para pinturas e outros objetos, os quais podem promover a intoxicação crônica denominada de saturnismo (plumbismo) em alusão astrológica à influência de Saturno [2,3]. 3.2.2 – Toxicocinética O chumbo existente no ambiente natural e ocupacional pode ser introduzido no organismo por meio de inalação (ar atmosférico) ingestão (contaminação da água, alimentos e solo) ou por via cutânea (compostos orgânicos do Pb). Sua absorção não dependerá apenas de sua concentração e tempo de exposição, mas também, de fatores relacionados às propriedades físico-químicas dos compostos, isto é, forma inorgânica ou orgânica. Na forma orgânica, a absorção ocorre de forma eficaz mesmo na pele íntegra, e no trato gastrointestinal (TGI) em um indivíduo adulto normal é de 5 a 10% . A absorção pelo TGI em crianças é bem maior de 40 a 50%; No sangue liga-se aos eritrócitos em 90%, sendo considerado este fato de fundamental importância na utilização desse tecido como indicador endógeno de exposição, sendo indicativo para o diagnóstico de intoxicação aguda e crônica pelo Pb. A distribuição do chumbo no organismo faz-se em dois principais compartimentos: o compartimento de permuta sangue e tecidos friáveis (mole), tais como fígado, rins e pulmões e o compartimento de armazenamento, constituído pelos tecidos não friáveis ou duros (fâneros – pelo, unhas, cabelo) e principalmente naqueles (90%) onde a forma de ligação bivalente é extremamente estável. A excreção é de 90% do chumbo ingerido, pois, é pequena absorção pelo organismo humano adulto sendo excretado nas fezes, sob forma de sulfetos insolúveis [3,4]. 3.2.3 – Toxicodinâmica A toxicidade do Pb é resultante, principalmente, de sua interferência no funcionamento das membranas celulares e enzimas, formando complexos estáveis com ligantes contendo enxofre, fósforo, nitrogênio, ou oxigênio (radicais: =C=O - SH, -H PO , -NH e -OH) que funcionam 2 3 2 como doadores de elétrons. Destacam-se: as interações bioquímicas do chumbo com radical sulfidrila (–SH) e a sua habilidade em competir com o cálcio nas diferentes atividades bioquímicas que exerce, de grande importância toxicológica [3,5]. 3.2.4- Sinais e Sintomas da Intoxicação Aguda e Crônica pelo Chumbo Aguda - São raros os casos de intoxicações agudas por este metal, todavia, os sintomas relatados são os seguintes: náusea, vômito, gosto metálico, sialorréia, cólicas abdominais, constipação intestinal. A ingestão e absorção de grande quantidade de chumbo, particularmente em crianças, podem causar encefalopatia grave, desânimo, irritabilidade, ataxia, letargia, coma e morte. Crônica – (Saturnismo) - Em adultos, os sintomas mais comuns são os seguintes: no SNC, fadiga, cefaléia, redução da memória e aprendizado, anorexia, incoor-denação motora, encefalopatias (menos freqüentes nos adultos), diminuição da libido e i m p o t ê n c i a s e x u a l ; n o t r a t o gastrointestinal, cólica abdominal, náusea, vômitos e dor epigástrica; alterações hematológicas, anemia normocítica ou 78 microcitica hipocrômica; alterações cardíacas, arritmia cardíaca, fragilidade capilar, ataxia, convulsão e morte [2,3,5]. 3.2.5 - Níveis de Plumbemia Em relação ao nível de Pb no sangue, a norma regulamentadora (NR-7/MT) considera o nível Pb normal sangüíneo ou valor de referência (V.R.) = 40,0 ug/dL, Índice Biológico Máximo Permitido (IBMP) = 60,0 ug/dL [3,5,6]. 3.2.6 - Tratamento – (Saturnismo) O tratamento com a agente quelante é realizada empregando-se o Versenate (CaNa EDTA), Dimercaprol (BAL), Succimer 2 ou DMSA (ácido 2,3-dimercapto-succinico) [6,7,8,9]. 3.3 - Toxicologia do mercurio (Hg) 3.3.1 – Introdução A maior fonte ambiental de mercúrio é o desgaste da crosta terrestre seguido pela atividade de mineração, que liberam para atmosfera quase 10.000 toneladas por ano. O mercúrio é utilizado: soda cáustica e gás cloro, lâmpadas p.135-41fluorescentes, baterias e instrumentos científicos (Exs: termômetros, barômetros). A exposição ao mercúrio também é possível na preparação de amálgamas para restauração de dentes [9]. 3.3.2 – Toxicocinética Mercúrio Metálico (Hg0): O mercúrio metálico é bem absorvido por inalação (80%) e muito pouco absorvido por via oral 0 (<0,01%). No sangue, parte do Hg é distribuída para os tecidos e parte é oxidada ++a Hg . O mercúrio metálico atravessa a barreira hematoencefálica e seu acúmulo no cérebro é maior que em qualquer outro tecido. A forma oxidada é excretada primariamente pela urina e fezes (via bile), com tempo de meia-vida de 35 – 90 dias [3,9]. Mercúrio Inorgânico (HgCl ): A absorção 2 oral de mercúrio inorgânico é moderada (7 – 15%). A absorção dérmica e alveolar pode causar toxicidade. Essa forma de mercúrio não atravessa a barreira hematoencefálica. A excreção é principalmente fecal (via bile) e renal. Esta últ ima crescendo em participação após exposição prolongada. O tempo de meia-vida é de 40 – 60 dias [3,9]. Mercúrio Orgânico (Hg-CH ): O mercúrio 3 orgânico é bem absorvido por via oral (>90%), por inalação de vapores e por via dérmica. Para os organomercuriais a biotransformação ocorre por clivagem na ligação Hg-alquil gerando a forma oxidada ++Hg , excretada via fezes (90%) e via urina. No fígado, o metilmercúrio forma um complexo solúvel com a cisteína e com o glutationa. Esse complexo é excretado pela bile, podendo ser reabsorvido pelo trato gastrintestinal. A circulação entero- hepática é responsável pelo tempo de meia- vida de cerca de 70 dias para o metilmercúrio [3,9]. 3.3.3 - Toxicodinâmica Existem 3 formas de mercúrio: elementar, inorgânico e orgânico, cada qual com sua toxicidade e efeitos tóxicos característicos. O mercúrio orgânico presente nos peixes, é transformado em cloreto de metilmercúrio por ação do suco gástrico e, dessa forma, é absorvido pelo homem. As formas de mercúrio mais comuns na exposição ocupacional são a metálica e a inorgânica. A afinidade do mercúrio por grupos sulf idri la é responsável por sua ligação a biomoléculas, com conseqüente inibição de uma grande variedade de enzimas e mecanismos de síntese e transporte de proteínas, que contribuem para sua toxicidade. A tríade clássica para a exposição crônica a níveis elevados de mercúrio metálico é: aumento da excitabilidade, tremores e gengivite. Para níveis de média intensidade, foram observados tremores finos, inicialmente 79 nas mãos, que mesmo afastada a exposição, podem levar anos para regredir. A exposição crônica de baixa intensidade tem sido associada com sintomas menos pronunciados de eretismo, incluindo fadiga, perda de memória e depressão. A tríade clássica para exposição crônica a organomercuriais inclui: disartria, ataxia e d iminu i ção do campo v i sua l . A neurotoxicidade pode tornar-se irreversível (sequela). Para a forma inorgânica, o órgão alvo é o rim. Em exposição crônica os efeitos tóxicos podem evoluir de uma proteinúria, reversível após afastamento de exposição, até evoluir para síndrome nefrótica [3,9]. 3.3.4 - Monitorização Biológica Só existe correlação entre níveis biológicos de mercúrio no sangue e urina e níveis de exposição ao metal, cerca de um ano após exposição contínua, quando se estabelece o equilíbrio entre absorção e excreção. Mercúrio no sangue (Hg-S): Hg-S é um indicador de exposição recente. O sangue pode ser colhido em qualquer momento durante a jornada de trabalho. Na literatura especializada encontramos como VR: < 1μg/dL. O I.B.M.P. é 2μg/dL (NR7/MT) [3,9]. Mercúrio na urina (Hg-U): Hg-U é um bom indicador para exposição a mercúrio inorgânico. Níveis elevados de Hg-U estão bem correlacionados com sintomas. A avaliação de mercúrio na urina só é útil para monitorização quando os indivíduos são expostos por tempo suficiente para que o estado de equilíbrio seja alcançado. Esse período de latência pode chegar a 10 dias para exposições elevadas e 6 meses para exposições brandas. VR: até 5μg/g creatinina. IBMP: 35μg/g creatinina. (NR7/MT) [3,9]. 3.3.5 – Tratamento O tratamento é feito à base de agentes quelantes -Dimercaprol (BAL), DMSA, e Versenate [3,6,10]. 3.4 - Toxicologia do arsênio (As) 3.4.1 – Introdução O arsênio encontra-se amplamente distribuído na natureza, presente em mais de 150 minerais diferentes. Alguns organismos marinhos extraem o As da água e acumulam o metal sob a forma inorgânica ou, mais comumente, sob a forma orgânica ( d ime t i l a r sena to , a r senobe ta ina , arsenocolina ou diferentes arseno- açúcares). Sob o ponto de vista da exposição ocupacional os principais compostos seriam a arsina, o trióxido de arsênico e o pentóxido de arsênico. A exposição pode ocorrer no refinamento do As e produção de inseticidas e outros compostos contendo arsênio; na indústria de semicondutores e dispositivos eletrônicos, na produção de ácido sulfúrico e na produção do vidro [3,9a]. 3.4.2 – Toxicocinética A absorção do arsênio pode ocorrer por via oral ou pulmonar. A via oral é mais importante na exposição não-ocupacional, enquanto que a pulmonar prevalece no ambiente de trabalho. A absorção oral do trióxido de arsênio é grande (>90%) enquanto os compostos menos solúveis são pouco absorvidos (<30%). A absorção pulmonar é restrita à fração respirável e depende da solubilidade do composto. Para os compostos hidrossolúveis como o trióxido de arsênio, a absorção é rápida. Os compostos insolúveis como arsenato de cálcio, arsenato de chumbo, entre outros, tendem a ficar retidos nos pulmões. O arsênio inorgânico trivalente pode ser biotransformado a As pentavalente, mas a principal via de biotransformação envolve a metilação, produzindo acido metil e dimetil arsônico, que são menos tóxicos que o As inorgânico. A forma pentavalente é reduzida à forma trivalente e 80 sexo mascul ino , ut i l izando avaliações espermáticas (aspectos quantitativos e qualitativos), análises de biomarcadores de fertilidade, dosagens hormonais, avaliações histopatológicas e morfométricas, testes de fertilidade, comportamento sexual, acasalamentos naturais e inseminação artificial. Com o passar dos anos vem crescendo nosso interesse sobre a Biologia Epididimária, sendo que os trabalhos experimentais acabam por desvendar, além dos efeitos tóxicos, aspectos da histofisiologia normal deste importante órgão do aparelho reprodutor masculino. No momento, estão em andamento no Laboratório estudos sobre metais pesados, drogas antineoplásicas e anorexígenas, praguicidas, plastificantes, distúrbios metabólicos (diabetes, obesidade e restrição protéica) e biologia e toxicologia do epidídimo, temas que serão abordados a seguir. 1 – Introdução O interesse pelo estudo da Biologia e Toxicologia da Reprodução Masculina vem crescendo nos últimos anos, especialmente porque, na espécie humana, tem sido descrito o decréscimo progressivo na densidade espermática, devido, pelo menos em parte, pela exposição a fatores ambientais [1]. Além disso, nas últimas décadas, foi registrado o aumento da i n c i d ê n c i a d e h i p o s p a d i a s e criptorquidismo. Estão disponíveis na literatura excelentes artigos e revisões sobre esse tema, inclusive detalhando os efeitos e mecanismos de ação de diferentes classes de agentes tóxicos, como metais pesados, solventes orgânicos, agentes físicos, praguicidas e outras substâncias químicas, além de técnicas de estudo [2-4]. Há 21 anos nosso Laboratório estuda, em animais experimentais, os efeitos reprodutivos de agentes tóxicos no CAPÍTULO 09 TÓPICOS EM BIOLOGIA E TOXICOLOGIA DA REPRODUÇÃO MASCULINA. Juliana Elaine Perobelli Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Estrutural - UNICAMP - Campinas - SP jperobelli@gmail.com Carla Tatiani Teixeira Graduanda do Curso de Ciências Biológicas do Instituto de Biociências - UNESP - Botucatu - SP carlinha_teixeira@yahoo.com.br Glaura Scantamburlo Alves Fernandes Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Estrutural - UNICAMP - Campinas - SP glaura_sf@yahoo.com.br Resumo: Desde o início dos anos 90, grande atenção tem sido dada aos agentes químicos que apresentam potencial de mimetizar ou antagonizar os efeitos dos hormônios esteróides. A exposição a estes compostos químicos, chamados desreguladores endócrinos, associado ao estilo de vida, têm sido apontados como fatores responsáveis pelo número crescente de problemas reprodutivos na população masculina. Este capítulo visa apresentar noções básicas sobre Biologia e Toxicologia da Reprodução Masculina, enfatizando as linhas de pesquisa desenvolvidas no Laboratório de Biologia e Toxicologia da Reprodução e do Desenvolvimento – IBB/Unesp (ReproTox), coordenado pela Profa. Dra. Wilma De Grava Kempinas. 83 redução da capacidade reprodutiva de homens [8]. O arsênio tem sido utilizado como uma terapia alternativa para o tratamento da leucemia promielocítica aguda (APL), no entanto, seus efeitos colaterais sobre a reprodução masculina ainda foram pouco estudados. Porém já foi demonstrada uma ação inibitória sobre o testículo causando diminuição nas concentrações sanguíneas de LH e FSH [9,10]. Atualmente estão sendo desenvolvidos os projetos intitulados: “Exposição de ratos machos adultos ao metilmercúrio: parâmetros reprodutivos e histofisiológicos associados à fertilidade e quantificação das diferentes espécies químicas de mercúrio”; “Avaliação de parâmetros reprodutivos de ratos machos adultos expostos ao metilmercúrio”; “Avaliação de parâmetros reprodutivos de ratos machos, púberes e adultos, expostos ao cádmio in útero e durante a lactação” ; “Toxic idade reprodutiva do trióxido de arsênio sobre a estrutura do trato genital e função reprodutiva de ratos machos adultos”. 3 - Drogas 3.1 – Antineoplásicas O câncer tornou-se uma das mais importantes doenças da modernidade, sendo alvo de inúmeros estudos de diagnóstico e tratamento. Várias drogas antineoplásicas são utilizadas e têm sua capacidade terapêutica comprovada, porém os efeitos colaterais promovidos por estas são, em muitos casos, tão importantes quanto à eficácia, especialmente sobre o sistema reprodutor masculino. A cisplatina é um dos agentes antineoplásicos mais amplamente utilizados na oncologia clínica, para o tratamento de vários tipos de tumores sólidos [11], especialmente os testiculares, 2 – Metais Os metais são compostos encontrados naturalmente na crosta terrestre, sendo também provenientes da mineração, erosão do solo, descarga industrial, praguicidas, poluição radioativa, entre outros. Entre estes compostos, estão os metais pesados que, em sua maioria, apresentam alta solubilidade em água e são facilmente absorvidos pelo tecido de plantas e animais, se l igando a biomoléculas como proteínas e ácidos nucléicos, prejudicando suas funções. O mercúrio, o chumbo, o cádmio e o arsênio são metais pesados extremamente tóxicos, que não possuem nenhuma função dentro dos organismos e a sua acumulação pode provocar graves doenças, sobretudo no aparelho reprodutor masculino [5]. Estudos recentes demonstram que o metilmercúrio, forma orgânica do mercúrio, é um agente agressor ao aparelho reprodutor masculino que acarreta danos na espermatogênese, diminui peso de órgãos reprodutores e reduz os níveis plasmáticos de testosterona [6]. Os efeitos deletérios do chumbo sobre a reprodução masculina são conhecidos há muito tempo, porém são escassos e inconclusivos, até mesmo contraditórios. Em trabalho realizado por KEMPINAS et al. [7 ] foram observadas a l terações neuroendócrinas em ratos expostos ao chumbo, sugerindo que a interferência com a inervação autônoma seja um dos mecanismos envolvidos com os efeitos desse metal sobre as vias espermáticas e glândulas sexuais acessórias. O cádmio é um metal que pode afetar diretamente os testículos, e mesmo após exposição moderada há um aumento na morfologia anormal dos espermatozóides, diminuição da motilidade espermática e 84 a carência de informações na literatura sobre os efeitos reprodutivos da sibutramina, atualmente em nosso Laboratório está sendo desenvolvido o projeto intitulado: “Efeitos da sibutramina sobre o sistema reprodutor masculino de ratos obesos”. 4 – Praguicidas Os praguicidas (fungicidas, herbicidas e inseticidas) são contaminantes químicos ambientais e potenciais desreguladores endócrino, ou seja, são capazes de mimetizar ou antagonizar os efeitos dos hormônios endógenos [17]. Estudo realizado com altas doses do inseticida fenvalerato (40mg/Kg) administradas a ratos adultos causaram diminuição do peso do testículo e epidídimo, bem como da contagem espermática nesses órgãos [18]. Fernandes et al. [19], mostraram que o herbicida diuron, na dose de 125mg/Kg causou diminuição na fertilidade de ratos machos adultos. Porém, sua administração in útero, lactação e pré-puberdade nas doses de 500, 750 e 1250ppm não causou alteração no sistema reprodutor masculino da prole [20]. A administração da mistura de praguicidas (dicofol, diclorvos, permetrina, endosulfan e dieltrin) em baixas doses (NOEL) e em doses efetivas (LOEL/LOAEL) causou redução da motilidade espermática de ratos adultos [21]. Atualmente, nesse contexto, o projeto em andamento em nosso Laboratório é intitulado “Mistura de praguicidas em baixas doses: efeitos sobre o trato reprodutivo de ratos machos, com ênfase sobre o epidídimo e a próstata”. 5 – Plastificantes Os ftalatos são ésteres utilizados na fabricação de plásticos transparentes empregados em indústrias e são que acometem indivíduos bastante jovens [12]. Como o tratamento destes pacientes jovens tem resultado em altos í n d i c e s d e c u r a [ 1 3 ] t o r n a - s e extremamente importante conhecer os reais efeitos reprodutivos causados por estes agentes e a possibilidade de recuperação destes efeitos, visando a melhoria da qualidade de vida dos pacientes curados. Considerando esta problemática, a t u a l m e n t e e n c o n t r a - s e e m desenvolvimento em nosso Laboratório o projeto intitulado “Avaliação imediata e t a r d i a d a f u n ç ã o r e p r o d u t i v a , desenvolvimento da progênie e fertilidade da prole masculina adulta de ratos tratados com cisplatina durante a puberdade”. 3.2 – Anorexígenas A obesidade está rapidamente se tornando uma epidemia mundial, contribuindo para o aumento da incidência de problemas cardiovasculares, diabetes e hipertensão [14]. Fatores genéticos, dieta e esti lo de vida são os principais responsáveis pelo desenvolvimento da obesidade. Pesquisas estatísticas revelam que o problema da obesidade tem aumentado 12-20% nos homens e 16-25% nas mulheres nos últimos 10 anos [15]. Muitos pacientes têm dificuldade de perder peso e mantê-lo, quando o perdem, é apenas através de dietas e exercícios. Contudo, o tratamento médico inclui somente alguns tipos de drogas como, por exemplo, a sibutramina, recentemente utilizada para o tratamento da obesidade em muitos paises. A ação da sibutramina sobre órgãos do aparelho reprodutor masculino aponta a ejaculação anormal como um efeito adverso [16]. Considerando a crescente utilização de fármacos para o tratamento da obesidade e 85 Entretanto, poucos estudos se atentaram para as possíveis conseqüências sobre o epidídimo e maturação espermática de um rato que sofreu tal exposição no período pré-puberal, momento em que o epidídimo passa por mudanças que resultam no desenvolvimento de um ducto único que se diferencia em algumas regiões com morfologia, função, atividade e expressão gênica particulares [52]. A puberdade constitui um conjunto de t r ans fo rmações somát i cas cu jos mecanismos primários ainda não estão totalmente esclarecidos, mas parecem resultar de interações entre fatores genéticos, hormonais e ambientais [53]. A exposição a contaminantes ambientais tem sido apontada como um dos fatores r e sponsáve i s po r a l t e r ações no desenvolvimento infantil resultando em precocidade ou atraso na puberdade. Enfocando esta problemática, nosso Laboratório está desenvolvendo os projetos de pesquisa intitulados “Morfo-fisiologia epididimária de ratos púberes e adultos sujeitos à privação de andrógeno durante o período pré-puberal” e “Puberdade retardada no rato macho: correlações entre indicadores externos e internos e repercussões sobre a qua l idade espermática e fertilidade”. 8 - Considerações finais Com o advento de técnicas modernas, a Toxicologia da Reprodução é uma ciência que vai se desenvolver expressivamente nos próximos anos, além do que novas substâncias químicas continuam a ser desenvolvidas e colocadas no mercado e em contato com os seres vivos e o meio ambiente. As perspectivas futuras do Laboratório são continuar investigando os aspectos normais e anormais da reprodução masculina, aprimorar as metodologias já utilizadas e investir na ducto epididimário é espécie- específico. Durante o trânsito dos espermatozóides pelo epidídimo ocorre a maturação espermática, de forma que uma alteração no tempo da passagem dos gametas pelo ducto pode alterar este processo [46,47]. Fernandez et al. [48], concluíram que a aceleração do tempo de trânsito espermático no epidídimo pareceu prejudicar a maturação normal dos espermatozóides nos ratos, diminuindo a qualidade espermática e a capacidade fértil, de maneira andrógeno-dependente. Durante o trânsito espermático pelas diferentes porções do epidídimo ocorre a translocação e o aumento da expressão de uma proteína espermática, de origem testicular, denominada SP22 [49]. Esta proteína tem sido correlacionada com a fertilidade [49] e com alguns parâmetros espermáticos [50]. Assim, alterações no p r o c e s s o d e m a t u r a ç ã o d o s espermatozóides podem ser identificadas pela análise da expressão de SP22, que é considerada um biomarcador de fertilidade. Há um aumento do interesse público a respeito da possibilidade do declínio na qualidade do sêmen humano estar relacionado a exposições a compostos químicos ambientais e a produtos farmacêuticos. Esses químicos, chamados desreguladores endócrinos, podem mimetizar ou antagonizar o efeito dos hormônios esteróides do organismo. Se pesquisas futuras confirmarem que este suposto declínio está de fato acontecendo, e a exposição a compostos químicos está relacionada à qualidade espermática, o epidídimo deve, certamente, ser considerado um possível órgão alvo [51]. A literatura já apresenta dados sobre a exposição a agentes químicos durante a v ida pré-nata l e adul ta e suas conseqüências sobre o epidídimo. 88 Oncol., v.24, p.68-74. 2006. [13] KOPP, H.G. et al. Advances in the treatment of testicular cancer. Drugs, v.66, p.641-659. 2006. [14] TAN, H.M.; GUNDLACH, A.L.; MORRIS, J.M. Exaggerated feeding response to central galanin-like peptide administration in diet-induced obese rats. 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[49] KLINEFELTER G.R. et al. Localization of the sperm protein SP22 and inhibition of fertility in vivo and in vitro. J. Androl., v.23, p.48-63, 2002. [50] FAVARETO A.P.A. et al. Identification of the SP22 sperm protein in Santa Inês and Dorper rams. Reprod. Domest. Anim., dez. 2008. DOI: 10.1111/j.1439-0531.2008.01313.x. [51] KLINEFELTER, G. R. Actions of toxicants on the structure and function of the epididymis. In: ROBAIRE, B.; HINTON, B. T. (Eds.). The Epididymis: from molecules to clinical pratice. 1. ed. New York: Kluwer Academic/ Plenum Publisher, 2002. p. 353-369. [52] RODRÍGUEZ, C.M., KIRBY, J.L., HINTON, B.T. The development of the epididymis. In: ROBAIRE, B.; 90 calórico. Existem poucos relatos do uso de sibutramina durante a gravidez e a maioria dos estudos refere-se ao primeiro trimestre de gestação [12,13]. Considerando-se a carência de informações na literatura sobre os efeitos reprodut i vos e te ra to lóg icos da sibutramina, assim como a discrepância entre alguns resultados, atualmente esta sendo realizado no nosso Laboratório o estudo intitulado “Performance reprodutiva em ratas tratadas com sibutramina”. 3 - Desreguladores endócrinos Desde o início dos anos 90, grande atenção tem sido dada aos agentes químicos que apresentam potencial para alterar o sistema endócrino de animais, incluindo o homem. O campo de estudo destes compostos, chamados de desreguladores endócrinos, tem crescido rapidamente e engloba diversas áreas, como imunologia, toxicologia, fisiologia da reprodução, comportamento e ecologia [14]. Estes compostos desreguladores endócrinos pertencem a diferentes categorias e origens, incluindo praguicidas, químicos industriais, farmacêuticos e fitoquímicos [15]. 3.1 – Ftalatos Uma classe de produtos químicos que vem chamando a atenção por ser amplamente encontrada como substância contaminante no meio ambiente são os ésteres de ftalato. Aproximadamente 90% da produção global de ftalatos é destinada para uso em plástico PVC (cloreto de polivinila) para fabricação de diversos materiais, como materiais médico- hospitalares e embalagens plásticas maleáveis de uso comercial como mamadeiras, brinquedos e garrafas de refrigerante e água. Os outros 10% são utilizados em produtos diversos como adesivos, solventes, lubrificantes, loções corporais, esmaltes, perfumes e produtos farmacêuticos. Vários trabalhos têm demonstrado que os ftalatos podem afetar negativamente a função reprodutiva de animais de laboratório [16,17]. Alguns estudos sugerem uma associação entre exposição humana a ftalatos e alterações nos parâmetros reprodutivos [18]. Avaliando- se o sexo e a idade mais propensos a exposição ao ftalato, descobriu-se que mulheres em idade reprodutiva podem chegar a uma exposição até 20 vezes maior que a população de um modo geral, acima dos níveis seguros estabelecidos [19]. Os ésteres de ftalato possuem a capacidade de atravessar a placenta e passar também pelo leite materno, tornando- se, assim, um risco significante p a r a e x p o s i ç ã o d e f e t o s e m desenvolvimento e recém-nascidos. Além disso, os ésteres de ftalato são plastificantes suspeitos de apresentar uma atividade hormonal desregulatória, podendo atuar como agentes anti- androgênicos e estrogênicos. Considerando-se a importância destes compostos devido a sua ampla utilização e contínua exposição humana, foi desenvolvido no Laboratório ReproTox o trabalho “Função reprodutiva de ratas expostas ao ftalato in utero e lactação” que visou avaliar os possíveis efeitos da exposição aos ftalatos sobre o sistema reprodutor feminino, em ratas cujas mães foram expostas a este composto durante o período gestacional e lactacional. O artigo completo encontra-se em apreciação por revista internacional. 3.2 - Propionato de testosterona 93 Existem vários indícios de que os distúrbios reprodutivos femininos vêm aumentando nos últimos anos. Este fato é atribuído a mudanças culturais (como uso de anticoncepcionais), mas a exposição a substâncias presentes no ambiente também podem contribuir para efeitos negativos no desenvolvimento e função do trato reprodutivo feminino, especialmente se esta exposição ocorrer em períodos críticos de desenvolvimento (como período intra-uterino e pós-natal). Seres humanos são expostos a uma variedade de químicos ambientais durante o período intra-uterino, nas concentrações similares àquelas que apresentam aumento na incidência de disfunções em animais de laboratório. O sistema reprodutor feminino pode ser alvo de andrógenos, tanto como resultado da exposição a químicos ambientais, quanto por condições patológicas (como síndrome do ovário policístico ou hiperplasia congênita da adrenal). Embora pesquisas iniciais tenham demonstrado estrógenos e ant i- androgênicos ambientais, compostos com a t i v idade androgên ica t êm s ido encontrados como contaminantes de rios e em animais destinados a alimentação humana nos Estados Unidos e Europa [20, 21]. Embora houvesse suspeitas desde 1970, a presença de andrógenos de origem antropogênica no ambiente só foi confirmada nos últimos anos [22]. Os estudos dos efeitos de andrógenos são importantes para o entendimento da fisiologia normal, pato-fisiologia e desenvolvimento do sistema reprodutor feminino. Usualmente, pouca atenção é desprendida em relação ao estudo de efeitos androgênicos no eixo reprodutivo feminino. Assim sendo, encontra-se em desenvolv imento, no Laboratór io ReproTox, o trabalho intitulado “Estrutura do trato genital e função reprodutiva de ratas expostas a propionato de testosterona in utero e durante a lactação”, para tentar esclarecer os efeitos do tratamento com agentes androgênicos durante a fase de desenvolvimento do sistema reprodutor feminino. 4 - Toxicologia do desen- volvimento Até 1940, acreditava-se que, no homem e em outros mamíferos, o embrião e o feto eram tão eficientemente protegidos pelo organismo materno de influências externas adversas que , nesses casos , as malformações só poderiam ser atribuídas a fatores genéticos. Esta crença começou a ser abalada pelas observações de Gregg em 1941. Este autor relacionou a ocorrência de aumento na freqüência de aparecimento de defeitos congênitos (alterações cardíacas, oculares, auditivas e retardo mental) associada à infecções maternas causada por uma epidemia do vírus da rubéola. A idéia de que as malformações humanas se deviam essencialmente a causas genéticas só foi descartada quando a ingestão de talidomida durante a gravidez foi associada ao aparecimento de defeitos congênitos. A talidomida constituiu um marco da história da Teratologia porque mostrou, de forma dramática, que o embrião humano poderia ser afetado adversamente pela exposição materna a substâncias químicas [23]. Outro evento marcante na Teratologia foi o aparecimento de câncer de vagina e malformações do aparelho reprodutor em descendentes de mulheres que utilizaram dietilestilbestrol durante a gestação [24]. A constatação de que agentes químicos podem interferir com o desenvolvimento embrionário levou à realização de testes em animais de Laboratório e de estudos epidemiológicos. Esses estudos têm como finalidade identificar substâncias 94 embriotóxicas que a população esteja ou venha a estar exposta [1]. Dentre os protocolos utilizados está a investigação das anomalias congênitas, estudada pela Teratologia. Teratologia (do grego “terato”, que significa “monstro”), é um ramo da ciência que estuda o desenvolvimento pré-natal anormal em todos os seus aspectos, incluindo as causas e os mecanismos pelos quais são produzidas as anomalias c o n g ê n i t a s . A T o x i c o l o g i a d o Desenvolvimento é o ramo da Toxicologia que estuda a cinética e os efeitos de agentes químicos que inter ferem com o desenvolvimento pré e pós-natal, assim como os mecanismos subjacentes. A toxicidade para o desenvolvimento mani fes ta-se como mal formação estrutural, retardo do crescimento, prejuízo funcional e a morte do organismo. Comparada à Teratologia, a Toxicologia do Desenvolvimento é considerada uma ciência relativamente nova [25]. Para o estudo das anomalias congênitas em nosso Laboratório são utilizadas ratas. Para o acasalamento, essas ratas são colocadas na presença de um rato macho durante o período noturno. Na manhã subseqüente, são feitos os esfregaços vaginais para confirmação da prenhez. Antes do nascimento, as ratas são anestesiadas submetidas à laparotomia, com exposição dos cornos uterinos para observação e contagem dos pontos de implantações, nódulos de reabsorção e do número de fetos vivos e mortos. Os ovários são retirados e observados com auxílio de lupa para a contagem dos corpos lúteos [25]. A taxa de perdas pré-implantação é calculada pela fórmula [(nº corpos lúteos nº implantações) / nº corpos lúteos] x 100. A porcentagem de perdas pós-implantação é calculada pela fórmula [(nº implantações nº de fetos vivos) / nº implantações] x 100 (Damasceno et al., 2008). Na ausência de pontos de implantações visíveis no útero, o órgão é imerso em solução de Salewski para coloração e confirmação destes eventuais pontos [26]. Os fetos e suas respectivas placentas são imediatamente retirados, pesados e analisados quanto às anomalias externas (observação minuciosa dos olhos, boca, implantação de orelhas, conformação c ran iana , membros anter io res e posteriores, cauda e perfuração anal) [27]. Após o exame externo, metade dos recém- nascidos de cada ninhada é processada para análise de anomalias viscerais, utilizando-se o método de secção seriada de Wilson [27]. A outra metade dos recém- nascidos é processada para análise das anomalias esqueléticas segundo técnica de Staples e Schnell [28]. Os pontos de ossificação (esternébrios, falanges anteriores e posteriores, metacarpos, metatarsos e vértebras caudais) são observados e contados para avaliação do desenvolvimento fetal, conforme método proposto por Aliverti et al. [29]. Diversos estudos podem ser realizados utilizando as técnicas acima descritas, dentre elas a utilização de substâncias químicas (plantas - tanto as de uso medicinal, quanto as de uso abortivo - metais pesados, agrotóxicos, drogas de abuso, medicamentos, etc.), fatores físicos (radiação, temperatura, exercício físico, etc.) e fatores biológicos (por exemplo, d o e n ç a s i n f e c c i o s a s e d o e n ç a s metabólicas). Umas das linhas de pesquisa de nosso grupo é o estudo dos efeitos de plantas na gestação. Uma das plantas utilizadas foi o óleo essencial de Citrus aurantium L., conhecida popularmente como laranja- amarga, usada para diversos tratamentos como, por exemplo, redutor de peso. 95