6 eletroforese gel rot prof

6 eletroforese gel rot prof

(Parte 1 de 2)

Programa de pesquisas aplicadas sobre a melhoria do ensino público no Estado de São Paulo - FAPESP Parceria USP-São Carlos e EESOR 1/6

Atividades de apoio em Biologia Celular e MMoolleccuullaarr

Aluno: _ nº _ série:

Técnicas de manipulação de DNA: “Tesouras de DNA” e “Eletroforese em gel”

As enzimas de restrição são proteínas produzidas por bactérias para prevenir ou restringir a invasão de um DNA estranho, cortando o DNA invasor em diversos fragmentos sem função.

Elas reconhecem e cortam locais específicos da molécula de DNA (chamados de sítios de restrição). O sítio é geralmente formado por uma seqüência de 4 a 8 pares de bases nitrogenadas, chamados palíndromo (iguais em sentidos opostos). Em biotecnologia, elas podem ser usadas para cortar (digerir) um DNA de interesse.

Por exemplo, a seqüência a seguir corresponde ao sítio de restrição da enzima EcoRI.

5’ GAATTC 3 3’ CTTAAG 5’

Esta enzima reconhece estes 6 pares de bases e corta a fita dupla do DNA entre as bases G e A. Veja o esquema abaixo:

Sítios de clivagem:5’ ...G AATTC... 3’
3’…CTTAA G5’

↑↑↑↑ Após a clivagem, o DNA separa-se em pedaços cujas extremidades são:

5’ …GAATTC… 3’
3’ …CTTAA G5’
↓↓↓↓↓↓↓↓

Exemplos de sítios de restrição de algumas enzimas: HindIII: 5’ AAGCTT 3’’ BamHI: 5’ GGATCC 3’

3’ TTCGAA 53’ CCTAGG 5’
↑↑↑↑↑↑↑↑
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SmaI: 5’ CG 3’ DraI: 5’ TA 3’

3’ GC 5’3’ AT 5’
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Simulação 1

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Os esquemas do anexo 1 representam duas moléculas de DNA dupla fita. As linhas verticais entre os pares de base representam as pontes de hidrogênio. 1. Vamos simular a atividade da enzima EcoRI. Procure ao longo da seqüência da fita de DNA (tira 1) o sítio de restrição da EcoRI. Simule cortes usando o lápis para fazer o contorno do referido corte, exatamente entre as bases G e A do sítio de restrição em ambas as fitas. Agora, recorte o DNA, separando os pedaços cortados pela enzima de restrição. 2. Repita o procedimento com a tira 2, desta vez simulando a atividade da DraI.

Simulação 2

Nos esquemas do anexo 2 (próxima página) observam-se duas representações de uma molécula de DNA de 15.0 pares de bases. Cada representação mostra a localização dos sítios de restrição de duas enzimas: a EcoRI e a DraI. As linhas verticais representam os sítios de clivagem. Os números entre os sítios de clivagem correspondem ao tamanho (em pares de bases) dos fragmentos gerados pela digestão do DNA com a referida enzima.

Com uma tesoura, corte nos locais dos sítios de clivagem. Você deve ter percebido que os pedaços de DNA originados a partir da digestão com estas enzimas têm tamanhos (em pares de bases) diferentes.

Para separar estes “pedaços” você poderia utilizar a técnica de eletroforese em gel, já explicada na aula introdutória. Para isso, vamos utilizar o Esquema do gel de eletroforese, na próxima página. Tente construir o perfil que suas digestões mostrariam no gel. Como você já sabe o tamanho dos pedaços originados com a digestão das duas enzimas utilizadas (EcoRI e DraI), indique-os no Esquema do gel de eletroforese, pintando com um lápis e tendo como referência a escala de tamanho. Compare os dois perfis. O que você observa?

Anexo 1 Tira 1

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5’ – T A G A C T G A A T T C A A G T C A – 3’ 3’ – A T C T G A C T T A A G T T C A G T – 5’

Tira 2

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5’ – A T A T G G C T C T T T A A A G G A – 3’ 3’ – T A T A C C G A G A A A T T T C C T – 5’

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EcoRIDraI
Poços de amostras

Esquema do gel de eletroforese

Escala de tamanho em pares de bases

Anexo 2 Sítios de clivagem da enzima EcoRI

Sítios de clivagem da enzima DraI 1000 8000 6000

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PLANO DE AULA - ROTEIRO PARA O PROFESSOR Eletroforese em gel: migração de fragmentos de DNA

Introdução

Nas últimas quatro décadas, nosso conhecimento sobre a estrutura e função do DNA e sobre os processos bioquímicos que as células utilizam para modificar essa estrutura e cumprir suas funções tem crescido consideravelmente. Esse vasto conhecimento nos permitiu a manipulação do DNA fora do ambiente celular. Por exemplo, podemos clivar o DNA em fragmentos específicos, separar e isolar esses fragmentos, uni-los novamente, copiar o DNA e determinar sua seqüência de bases. Estamos fazendo uso de nossa experiência em manipulação de genes para aprofundarmos ainda mais nossos conhecimentos sobre como os processos básicos da vida são executados e como podemos fazer uso destes produtos em nosso cotidiano.

Nas próximas aulas, usaremos modelos e simulações para aprender as técnicas utilizadas pelos cientistas para analisar o DNA e produzir moléculas recombinantes: digestão por restrição, eletroforese em gel etc.

A eletroforese em gel pode ser utilizada para se fazer mapas de restrição, que é um diagrama de uma molécula de DNA mostrando as posições relativas dos sítios de clivagem das várias enzimas. O mapa pode ser feito clivando o DNA com duas ou mais enzimas de restrição, individualmente e em mistura. Depois, comparam-se suas migrações eletroforéticas, possibilitando assim a construção de mapas de restrição.

Uma outra aplicação bastante conhecida é na identificação de pessoas: em testes de paternidade, identificação de criminosos etc. O DNA das pessoas, depois de tratado (por clivagem), pode ser separado pela eletroforese, e comparado com outros DNAs, como o do suposto filho ou pai, DNA recolhido na cena de um crime etc. Como a informação genética contida em cada DNA é única para qualquer indivíduo, se as amostras de DNA apresentarem idêntico padrão eletroforético significa que são da mesma pessoa.

Pré-requisitos

Para estas atividades é necessário que o aluno conheça a composição do material genético, principais funções e estruturas.

Duração Aproximadamente 100 minutos.

Público alvo Segundo e terceiro ano do ensino médio.

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Eletroforese em gel: migração de fragmentos de DNA - procedimentos

Coloca-se o DNA e a enzima de restrição em um pequeno tubo e deixa a enzima agir.

Como não é possível usar corantes químicos para se verificar a digestão, utiliza-se o processo chamado eletroforese em gel, a fim de que se possa visualizar os fragmentos de DNA.

Os grupos fosfato do DNA são carregados negativamente. Assim, quando as moléculas são colocadas em um campo elétrico, elas migram para o pólo positivo, pois possuem cargas opostas.

Para que esta migração ocorra, é necessário um gel de agarose. Dissolve-se o pó de agarose em água fervente, colocando-o em um suporte adequado e, depois de resfriado, endurece, como se fosse uma gelatina. Durante este processo, um pente é colocado no gel ainda líquido para, após o endurecimento, formem-se “buracos” no gel, onde serão aplicadas as amostras. Estes buracos são chamados de poços de amostra (fig. 1).

Fig. 1. Fazendo um gel de agarose. (A) Para fazer um gel, a solução de agarose quente é vertida em uma bandeja e o pente é colocado no lugar adequado. (B) Depois que a agarose esfria e endurece, o pente é removido, deixando marcas no gel, chamadas de poços de amostra. Amostras são aplicadas nos poços antes da eletroforese.

Na eletroforese, o gel solidificado é colocado em uma cuba com uma solução salina (tampão). Quando a corrente é aplicada, entre as extremidades da cuba, as moléculas de DNA começam a migrar (fig. 2).

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