produtos naturais

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Universidade do Vale do Itajaí (UNIVALI)

Centro de Ciências Tecnológicas da Terra e do Mar (CTTMar)

Curso de Oceanografia

Disciplina: Produtos Naturais Marinhos

Docente: Kátia Kuroshima

Débora Conde

Ernani Vilela

Maiá Medeiros

ISOLAMENTO DE COMPOSTOS DA MACROALGA Laurencia microcladia COM MÉTODOS DE CCD (Cromatografia de Coluna Delgada) E CROMATROGRAFIA DE COLUNA

Itajaí, 2010

INTRODUÇÃO

As algas são amplamente utilizadas nas indústrias alimentícia, farmacêutica, de cosméticos e também na área de biotecnologia (MCHUGH, 2003 apud PIRES et al, 2008). O interesse nutricional está baseado em seu reduzido valor calórico e elevado teor de vitaminas, minerais e fibras dietárias (ITO; HORI, 1989 apud PIRES et al, 2008).

O ambiente marinho, principalmente nas regiões tropicais, apresenta uma diversidade de espécies comparável a aquela presente nas florestas tropicais. Esta riqueza de espécies é capaz de produzir uma enorme variedade de estruturas químicas com um potencial elevado para descoberta de novos fármacos (Molinski et al, 2009 apud MACHADO et AL, 2010).

Nas últimas três décadas, a descoberta de metabólitos com atividade biológica a partir de macroalgas cresceu substancialmente (Smit, 2004 apud MACHADO et al, 2010). Entre elas, as algas vermelhas estão entre as principais produtoras de metabólitos secundários no ambiente marinho. Dentre as espécies mais estudadas mundialmente, encontram-se as algas do gênero Laurencia (Ceramiales, Rhodomelaceae) (Cardozo et al, 2007 apud MACHADO et al, 2010). O gênero é encontrado em mares subtropicais e tropicais de todo mundo, abrangendo cerca de 150 espécies. A pesquisa de metabólitos secundários do gênero Laurencia foi iniciada na década de 60 por Irie (1965). Desde então, mais de 500 substâncias foram isoladas (De Carvalho et al, 2006 apud MACHADO et al, 2010).

Acredita-se que a produção de metabólitos secundários esteja relacionada à adaptação da alga ao ambiente marinho. Estudos mostram que os metabólitos de Laurencia podem apresentar múltiplas funções, como proteção contra herbívoros e organismos incrustantes, aumentando a capacidade adaptativa do indivíduo ao ambiente (Pereira et al, 2003 apud MACHADO et al, 2010). A mediação destes metabólitos em interações entre organismos pode indicar que estas moléculas também atuem em outros sistemas biológicos. Desta observação parte a motivação para a busca de moléculas de interesse terapêutico. Muitos estudos têm verificado diferentes ações farmacológicas de metabólitos de algas do gênero Laurencia (Konig et al, 1994 apud MACHADO et al, 2010).

No litoral brasileiro, Laurencia constitui elemento importante na flora da região entremarés e do infralitoral, onde os seus talos se entrelaçam formando tufos, possibilitando abrigo a inúmeros animais, além de servir como substrato para variada flora de micro e macroalgas epífitas. Cerca de 20 espécies de Laurencia sensu lato foram descritas para o Brasil (Oliveira Filho, 1977, com atualizações contidas no site www.ib.usp.br/algamare-br).

CARACTERIZAÇÃO DOS GÊNEROS DO COMPLEXO LAURENCIA:

  • Quatro células periaxiais por segmento axial vegetativo;

  • Ramos espermatangiais desenvolvidos a partir da base do tricoblasto;

  • Tetrasporângios produzidos a partir das células periaxiais (tipo tricoblasto);

  • Depressão espermatangial em forma de taça;

  • Tetrasporângios são formados a partir de uma determinada célula periaxial, mas a 1ª sempre permanece estéril;

  • Presença de “corps en cerise” nas células corticais mais externas e nos tricoblastos. Geralmente, os tetrasporângios estão distribuídos ao longo do râmulo fértil (tipo paralelo) e as ligações secundárias presentes entre as células corticais adjacentes.

METODOLOGIA

O método utilizado neste trabalho de purificação foi o de Cromatografia em Camada Delgada (CCD), que consiste em separar substâncias através da migração diferenciada de acordo com diferentes polaridades de uma determinada substância.

A cromatografia é, fundamentalmente, um método físico-químico de separação dos componentes de uma mistura, realizada por meio da distribuição dos mesmos entre duas fases em íntimo contato. Uma das fases permanece estacionária enquanto a outra se move através dela. Durante a passagem da fase móvel pela estacionária, os componentes de uma mistura se distribuem entre elas, de tal forma que cada um dos componentes é retido seletivamente na fase estacionária, de acordo com sua maior ou menor interação, resultando em migrações diferenciadas.

A técnica consiste em aplicar uma camada fina do adsorvente finamente pulverizado (geralmente sílica ou óxido de alumínio, às vezes adicionados de material fluorescente à luz ultravioleta) sobre uma placa lisa e plana (vidro ou alumínio).

O procedimento realizado consistiu em etapas, entre elas, o teste inicial para a escolha do solvente foi realizado eluindo pequenas porções da amostra com auxílio de cinco compostos de diferentes polaridades:N-Hexano, Diclorometano, Acetato de Etila, Clorofórmio, Acetona e Metanol, com polaridades 0; 3,4; 4,3; 4,4; 5,3; 6,6 respectivamente. Selecionamos entre os solventes, o Clorofórmio e o Metanol, de polaridade 4,4 e 6,6. O primeiro teste em CCD foi feito um com Clorofórmio e outro com uma combinação dos dois, utilizando 50% de cada composto. Na segunda etapa, na cromatografia de coluna, como o melhor resultado obtido foi com o Clorofórmio, foi esse selecionado para ser o solvente na coluna cromatográfica.

A cromatografia em coluna é uma técnica de partição entre duas fases, sólida e líquida, baseada na capacidade de adsorção e solubilidade. O sólido deve ser um material insolúvel na fase líquida associada, sendo que os mais utilizados são a sílica gel (SiO2) e alumina (Al2O3), geralmente na forma de pó. No presente estudo foi utilizada a sílica sólida onde o tamanho varia de acordo com a necessidade de separação, quanto menor, maior a superfície de contato, e logo maior quantidade de amostra será “filtrada”. Em laboratório preparamos uma coluna com média de cinco centímetros de sílica sólida e feita a lavagem com Clorofórmio até que estivesse devidamente compactada para o início do processo.

A mistura a ser separada é colocada na coluna com um eluente menos polar e vai-se aumentando gradativamente a polaridade do eluente e conseqüentemente o seu poder de arraste de substâncias mais polares. No presente teste, escolhemos fazer a coluna com um solvente de média polaridade, 4,4. O fluxo de solvente deve ser contínuo. Os diferentes componentes da mistura mover-se-ão com velocidades distintas dependendo de sua afinidade relativa pelo adsorvente (grupos polares interagem melhor com o adsorvente) e também pelo eluente. Assim, a capacidade de um determinado eluente em arrastar um composto adsorvido na coluna depende quase diretamente da polaridade do solvente com relação ao composto. À medida que os compostos da mistura são separados bandas ou zonas móveis começam a ser formadas; cada banda contendo somente um composto, essas bandas foram recolhidas em pequenos recipientes para após teste em CCD. Em geral, os compostos apolares passam através da coluna com uma velocidade maior do que os compostos polares, porque os primeiros têm menor afinidade com a fase estacionária. Se o adsorvente escolhido interagir fortemente com todos os compostos da mistura, ela não se moverá. Por outro lado, se for escolhido um solvente muito polar, todos os solutos podem ser eluídos sem serem separados.

A espécie trabalhada foi Laurencia microcladia, uma alga vermelha (Rhodophyta) reconhecida como as maiores produtoras de substâncias halogenadas no meio marinho. As algas vermelhas do gênero Laurencia são conhecidas como uma riquíssima fonte de metabólitos secundários. As principais classes químicas já isoladas são terpenos - sesquiterpenos, diterpenos, triterpenos - e acetogeninas. Estudos apontam que estas substâncias apresentam importantes atividades biológicas, principalmente citotóxicas e antibacterianas. O gênero Laurencia Lamouroux (Rhodomelaceae, Ceramiales) destaca-se como uma fonte fascinante de novos produtos naturais. Em relação à investigação química da espécie Laurencia microcladia observa-se a predominância de compostos pertencentes à classe dos sesquiterpenos halogenados. Espécies do gênero Laurencia produzem compostos que atuam na defesa química contra diversos herbívoros marinhos, como os peixes presentes nos recifes de corais. No experimento utilizamos amostra bruta da espécie Laurencia microcladia.

Na continuação do processo, já com a amostra devidamente diluída e inserida na coluna, separamos frações para posterioriteste em CCD e identificação de novos extratos. No inicio do processo, foi possível visualizar a olho nu diferenciações na coloração dos extratos, podendo ou não sinalizar já a presença de substâncias. Foi feito na média de 70 extratos. Após, deixamos as amostras abertas para que o solvente sofresse evaporação e consequênte concentração a amostra.

No processo final da prática, algumas amostras foram aplicadas nas cromatoplacas em forma de soluções, mediante uso de um tubo capilar. Alguns cuidados devem ser tomados para evitar que a camada do adsorvente seja alterada, Soluções diluídas da amostra podem ser aplicadas repetidamente, esperando-se a evaporação do solvente antes de nova aplicação, a fim de obter maior concentração no ponto de partida. Mais de uma amostra pode ser aplicada em uma placa, mantendo-se uma distância de um centímetro entre os pontos, para evitar contato entre as amostras. A placa, com a extremidade semeada para baixo, é então mergulhada no solvente selecionado, mantido em cuba fechada (câmara). É importante observar que o nível do solvente deverá ficar abaixo dos pontos de aplicação. Durante a corrida do solvente o sistema deve permanecer fechado, para garantir saturação da câmara pelo vapor do solvente. A cromatoplaca deverá ser retirada da cuba somente quando a frente do solvente atingir um limite pré-determinado na parte superior da placa. Após o desenvolvimento as cromatoplacas são secas e as posições dos componentes da amostra visualizadas por um meio adequado. A visualização (revelação) pode ser feita por métodos físicos ou químicos. Placas preparadas com adição de um material fluorescente permitem visualizar facilmente compostos UV-ativos, que aparecem como manchas escuras em fundo fluorescente, se a placa for iluminada com lâmpada de luz ultravioleta. Ou através de uso de um revelador que após secagem em placa quente, revela a corrida da amostra sobre a placa.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

O ambiente marinho é um sistema extremamente competitivo, colonizado por uma grande variedade de algas e invertebrados, os quais competem por espaço (substratos sólidos), luz e nutrientes. Além disso, devem defender-se de microorganismos patógenos e de possíveis predadores. Os invertebrados marinhos, em particular as esponjas, tunicados e celenterados, carecem de sistema imunológico, defesa física e de possibilidade de escape, já que são, de modo geral, organismos frágeis. Portanto, devem biossintetizar ou incorporar na dieta suas próprias armas químicas de defesa, que permitirão sua sobrevivência em ecossistemas tão competitivos. Para os organismos fixados em um substrato sólido, a competição pelo substrato é crucial, e por isso, muitos destes produzem sustâncias com atividade “antifouling”, isto é, que inibem o assentamento de larvas ou células de organismos competidores. Esses compostos apresentam toxicidade elevada para células de alta taxa de reprodução, e por isso não surpreende que exista una alta correlação entre essa atividade e a atividade antitumoral (LHULLIER apud FAULKNER, 1998, 1999, 2000, 2001).

Fujii & Sentíes (2005) compilaram as diversas citações das espécies do complexo Laurencia para o litoral do Brasil, totalizando 24 espécies reportadas até aquela data. Entretanto, os autores advertiram que alguns táxons citados na fase anterior ao desenvolvimento ficológico no Brasil, nunca foram recoletados e outros não tiveram suas exsicatas examinadas para confirmação. Portanto, algumas espécies permanecem como citações duvidosas para o litoral brasileiro. Das vinte e quatro espécies listadas por Fujii & Sentíes (2005), 12 foram confirmadas para o Brasil. As doze restantes não confirmadas ou foram reduzidas a sinônimos pelos autores ou não foram reencontradas nem examinadas por falta de material de referência em herbário, ou ainda por falta de descrições diagnósticas adequadas.

Existem mais de 19 espécies catalogadas e na região sul predominam as espécies Laurencia catarinensis, L. microcladia, L. obtusa (Figura 1) e Palisadaflagellifera (LHULLIER, 2009).

Figura 1. Laurencia obtusa.

Teoricamente, como citado na introdução, os processos em laboratório devem ser regidos com o maior cuidado, onde devem ser tomados para que não haja interferência nos processos de CCD e coluna cromatográfica. Na CCD, como utilizamos compostos orgânicos, o cuidado no manuseio das placas é importante para que a gordura não interfira no decorrer da separação dos compostos. Na fase estacionária da CCD, onde a placa permanece pousada na cuba de cromatografia, é necessária a total estagnação da placa para que o solvente suba uniforme por toda a placa e não ocorram diferenças na separação. Na coluna, é importante manter a sílica sempre úmida para que não haja entrada de ar e consequênte interferência no processo.

Primeiramente foi feito a CCD com uma combinação de Clorofórmio e Metanol (Figura 2), e outro apenas com Clorofórmio (Figura 3) onde houve melhor separação pelo Clorofórmio.

Figura 2. CCD com 50% de Clorofórmio e 50 % de Metanol.

Figura 3. CCD apenas com Clorofórmio.

Visualiza-se que na Figura 1, a separação não ficou muito clara, exigindo talvez, outra combinação de solventes para que a amostra fosse separada com mais eficiência. Já na Figura 2, a corrida da amostra apresentou-se mais uniforme, apresentando em um determinado ponto claramente a presença de um composto. Após a realização da cromatografia de coluna (Figura 4), as amostras retiradas em pequenos frascos foram submetidas a uma verificação para confirmar se houve maiores separações de componentes da espécie em estudo. Fizemos placas de CCD para as nove primeiras separações, onde já foi possível perceber nas últimas que não havia mais compostos a serem separados, ou seja, a corrida na placa de CCD apresentou-se uniforme.

Figura 4. Exemplo de cromatografia de coluna

e separação de amostras

Juntamos então as amostras que apresentaram compostos semelhantes, foram essas, a 1,2 e 3, 4, 5 e montamos placas com a mistura dessas (Figura 5).

Figura 5. CCD para as frações 1, 2 e 3, 4, 5.

Como resultado da prática, conseguimos obter a separação clara de dois grupos de substâncias, onde para maiores detalhes seria necessária a montagem de outra coluna cromatografia para separar esses compostos previamente separados.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

FUJII, M. T. & SENTÍES, G. A. Taxonomia do complexo Laurencia (Rhodomelaceae, Rhodophyta) do Brasil, com ênfase nas espécies dos estados de São Paulo e do Espírito Santo. In: Sentíes, G. A. & Dreckmann, KM. (Eds). Monografias Ficológicas. II. México, Universidad Autônoma Metropolitana – Iztapalapa, México, Instituto de Botânica, São Paulo, Brasil, 69-135, 2005.

LHULLIER, Cintia. Investigação química de espécies do gênero Laurencia Lamouroux na costa sul brasileira. 293 f. Tese (Doutorado) – Programa Pós-graduação em Farmácia, UFSC, Florianópolis, 2009.

MACHADO, F. L. S. et al. Atividade biológica de metabólitos secundários de algas marinhas do gênero LaurenciaRevista Brasileira de Farmacognosia, Curitiba, v. 20, n. 03, jun.-jul., 2010. Mensal.

OLIVEIRA FILHO, E. C. 1977. Algas marinhas bentônicas do Brasil. Tese de Livre Docência, Universidade de São Paulo, São Paulo, 407 pp.

PIRES, K. M. S. et al. Teores de α-caroteno e β-caroteno em macroalgas marinhas desidratadas. Revista de Ciência Agronômica, Fortaleza, v. 39, n. 02, p.257-262, abr.-jun., 2008. Semestral.

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