Cinética enzimatica e inibição

Cinética enzimatica e inibição

1 – TEORIA

1.1 – Generalidades

As enzimas são proteínas especializadas na catálise de reações biológicas. Elas estão entre as biomoléculas mais notáveis devido a sua extraordinária especificidade e poder catalítico, que são muito superiores aos dos catalisadores produzidos pelo homem. Praticamente todas as reações que caracterizam o metabolismo celular são catalisadas por enzimas.

Como catalisadores celulares extremamente poderosos, as enzimas aceleram a velocidade de uma reação, sem, no entanto participar dela como reagente ou produto. Atuam ainda como reguladoras deste conjunto complexo de reações.

As enzimas são, portanto, consideradas as unidades funcionais do metabolismo celular.

A parte da enzimologia que estuda a velocidade das reações enzimáticas, e os fatores que influenciam nesta velocidade é a cinética enzimática. A cinética de uma enzima é estudada avaliando-se a quantidade de produto formado ou a quantidade de substrato consumido por unidade de tempo de reação.

Victor Henri propôs, em 1903, que uma enzima liga-se à molécula de seu substrato para formar o complexo ES (Enzima/Substrato), sendo este um passo obrigatório no processo catalítico enzimático. Esta idéia foi expandida em uma teoria geral da ação das enzimas, especialmente por Leonor Michales e Maud Menten, em 1913. Eles propuseram que a enzima primeiro combina-se reversivelmente com o substrato, para formar o complexo enzima-substrato, em um passo reversível relativamente rápido:

(Equação 1)

A seguir, em um passo mais lento, o complexo ES se rompe com o aparecimento da enzima livre e a formação do produto da reação, P:

(Equação 2)

A segunda reação é a mais lenta neste modelo e, por tanto, limita a velocidade da transformação global do reagente em produto. Disto resulta que a velocidade da reação enzimática deve ser proporcional à concentração da substancia reagente no segundo passo, ES.

1.2 – Inibição

Muitos fatores podem influenciar na cinética enzimática, tais como inibição por alguma substancia e condição externas, como, Ph e temperatura.

Um grande número de substâncias pode inibir a atividade enzimática. Algumas dessas substâncias são constituintes da célula e outras são estranhas, levando com a sua presença a alterações significativas do metabolismo. Quando o inibidor é produzido pela própria célula, a variação na sua concentração vai ser muito empregado pela própria célula como uma forma de controle da velocidade das reações. Esse mecanismo vai possibilitar ao organismo responder a diferentes condições fisiológicas.

Os inibidores podem ser reversíveis ou irreversíveis, de acordo com a estabilidade gerada pela sua ligação com a enzima:

  • Os inibidores irreversíveis se ligam as enzimas levando a inativação definitiva desta. Estes inibidores são muito tóxicos para o organismo já que não são específicos, sendo capazes de inativar qualquer enzima.

  • Já os inibidores reversíveis podem ser divididos em dois grupos: os competitivos e os não-competitivos. Essa divisão é baseada na presença ou não de competição entre o inibidor e o substrato pelo centro ativo da enzima.

- Os inibidores competitivos competem com o substrato pelo centro ativo da enzima. Estas moléculas apresentam configuração semelhante ao substrato e por isso são capazes de se ligarem ao centro ativo da enzima. Eles produzem um complexo enzima-inibidor que é semelhante ao complexo enzima-substrato.

- Os inibidores não-competitivos não tem semelhança estrutural com o substrato de reação que inibem. A sua inibição se dá pela sua ligação a radicais que não pertencem ao grupo ativo. Esta ligação vai alterar a estrutura da enzima e inviabiliza a sua catálise.

Fatores externos que podem influenciar são:

  • Temperatura: Quanto maior a temperatura, maior a velocidade da reação, até se atingir a temperatura ótima; a partir dela, a atividade volta a diminuir, por desnaturação da molécula. De modo geral as enzimas desnaturam-se em temperaturas acima de aproximadamente 60ºC.

  • Ph: Análogo à temperatura, existe um pH ótimo, onde a distribuição de cargas elétricas da molécula da enzima e, em especial do sítio catalítico, é ideal para a catálise. De modo geral, em Ph muito ácido ou alcalino, as enzimas são inativadas.

2 – EQUAÇÕES

2.1 – Equação de Michaelis e Menten

A figura 1 mostra a relação entre [S] e V0 para uma reação enzimática. A curva que expressa esta relação possui a mesma forma para a maioria das enzimas, sendo expressa pela Equação de Michaelis e Menten, derivada por estes pesquisadores partindo de sua hipótese básica de que, nas reações enzimáticas, o passo limitante da velocidade é a quebra do complexo ES para formar o produto e a enzima livre.

A equação de Michaelis-Menten (Equação 3) é a equação da velocidade para uma reação catalisada enzimaticamente e com um único substrato. É uma expressão da relação quantitativa entre a velocidade inicial V0, a velocidade máxima Vmáx e a concentração inicial de substrato [S], todas relacionadas através da constante de Michaelis-Menten, Km. a constante de Michaelis-Menten é uma constante dinâmica, ou de pseudo-equilíbrio, que expressa a relação entre as concentrações reais no estado estacionário ao invés de concentrações no equilíbrio.

(Equação 3)

Uma relação numérica importante emerge da Equação de Michaelis-Menten no caso especial quando V0 é exatamente a metade de Vmáx (figura 1). Então:

(Equação 4)

Km é equivalente à concentração de substrato no qual V0 é igual à metade de Vmáx, e indica a “afinidade” de uma enzima pelo seu substrato. Quanto menor for o valor de Km, maior será a afinidade da enzima pelo seu substrato.

2.1.1 – Ordem da reação

2.1.1.1 – Primeira ordem

Ocorre quando a concentração de substrato é bem menor que Km. Então:

(Equação 5)

Considerando

(Equação 6)

Onde K é a constante de velocidade de primeira ordem dada em min-1.

2.1.1.2 – Ordem zero

Ocorre quando a concentração de substrato é muito maior que Km.

(Equação 7)

2.2 – Equações com a presença de inibidores

2.2.1 – Inibidores Reversíveis competitivos

  • Equação de Michaelis-Menten com a presença de um inibidor competitivo, onde I indica o inibidor e KI é a constante de velocidade do inibidor.

(Equação 8)

2.2.2 – Inibidores Reversíveis não-competitivos

  • A equação da velocidade para esse caso é:

(Equação 9)

2.2.3 – Inibidores Irreversíveis

  • Equação de Michaelis-Menten com a presença de um inibidor irreversível é:

(Equação 10)

3 – EXEMPLOS DE CINÉTICA ENZIMATICA COM INIBIÇÃO

Um exemplo da aplicação de inibição enzimática pode ser demonstrado durante o processo de obtenção de álcool por Saccharomyces cerevisiae. Um trabalho realizado por SANTOS et al (2010) que teve como objetivo avaliar e compara processos em separado ou em simultâneo de bagaço de cana-de-açucar para obtenção de álcool por S. Cerevisiae, mostro que em seu processo ocorre um efeito inibitório e que foi feito algum processo para evitar tal inibição.

O bagaço de cana foi preparado e após isso o próximo passo é a hidrolise e a fermentação. A hidrólise enzimática é realizada por celulases (endoglucanase e exoglucanase), que quebram a celulose em celobiose, e esta é, subsequentemente, convertida em duas moléculas de glicose pela β-glucosidase. Entretanto, a atividade da endoglucanase é inibida pela celobiose e a da β-glucosidase pela glicose. Uma hipótese para se evitar inibição da β-glucosidase pela glicose é fazendo um processo continuo alimentado, no qual o produto é retirado na mesma proporção em que o reator é alimentado com substrato. Para esse trabalho a forma de evitar a inibição utilizada foi a sacarificação e fermentação simultâneas. Uma vez que a glicose está sendo formada, também está sendo consumida para a produção de etanol, levando a uma maior conversão de celulose.

Outro trabalho realizado na UFV (Universidade Federal de Viçosa) realizado por Monteiro et al (2004) mostrou a qualidade protéica de linhagens de soja com ausência do Inibidor de Tripsina Kunitz. Com esse trabalho foi mostrado que a eliminação genética do Inibidor de Tripsina Kunitz promove melhora acentuada na digestibilidade da proteína de soja, comprovando que esse inibidor é o principal fator antinutricional responsável pela diminuição da digestibilidade da proteína de soja e, conseqüentemente, pela menor absorção desta pelo organismo animal, sendo assim a soja poderá ser melhor aproveitada para diversos fins alimentícios.

4 – DIMINUIÇÃO DO EFEITO INIBITÓRIO

Sob determinadas condições, a velocidade de transferência do substrato em produto é proporcional à quantidade de enzima. Desvios da linearidade podem ocorrer devida a: presença de inibidores na própria solução de enzima; presença de substancias tóxicas; presença de um ativador que dissocia a enzima; e limitações impostas pelo método de análise. A fim de se evitar o efeito causado por estes fatores recomenda-se utilizar nos ensaios cinéticos, sempre que possível: enzimas com alto grau de pureza; substratos puros; e métodos de analise confiável.

Conhecer a cinética enzimática também é muito importante para diversos processos que dependem de enzimas, como por exemplo, a produção de etanol e derivados de leite, pois desta forma, conhecendo bem a cinética, fica mais fácil controlar fatores externos como ph e temperatura que podem atuar como fatores inibitórios.

5 – CONCLUSÃO

As enzimas estão presentes no nosso dia-a-dia mais do que possamos imaginar, além de serem vitais ao organismo podem auxiliar em vários fatores, até mesmo nas indústrias, como por exemplo, indústrias de alimentos como foi visto no decorrer do trabalho.

A cinética de reações apresenta diversos objetivos, dentre eles estão: Medir a velocidade das reações que se processam; Estudar a influencia de cndições de trabalho (concentração de reagente e das enzimas, temperatura, Ph, conentração de ativadores e de inibidores) naquelas velocidades; Correlacionar as velocidades das transformações com alguns dos fatores que as afetam; Colaborar na otimização de processos; Estabelecer critérios para controle de processos; e Projetar o reator mais adequado.

6 – REFERÊNCIAS

JUNIOR, A. F.; Enzimas e suas aplicações e cinética enzimática. Florianópolis, 2010.

MONTEIRO, M. R. P.; COSTA, N. M. B.; OLIVEIRA, M. G. A.; PIRES, C. V.; MOREIRA, M. A. Qualidade protéica de linhagens de soja com ausência do Inibidor de Tripsina Kunitz e das isoenzimas Lipoxigenases.Revista de Nutrição.2004; vol 17. Campinas – SP.

SANTOS, J. R. A.; SOUTO-MAIOR, A. M.; GOUVEIA, E. R.; MARTÍN, C. Comparação entre processos em SHF e em SSF de bagaço de cana-de-açúcar para a produção de etanol por Saccharomyces cerevisiae.Química Nova.Vol 33. São Paulo, 2010.

Apostila de cinética enzimática. Disponível em: <http://www.enq.ufsc.br/labs/probio/disc_eng_bioq/apostilas/Apostila_cinetica_enzimatica_ju.pdf >. Acesso em: 16 de novembro de 2010.

Enzimas. Disponível em:

<http://www.enq.ufsc.br/labs/probio/disc_eng_bioq/trabalhos_pos2003/const_microorg/enzimas.htm>. Acesso em: 16 de novembro de 2010.

UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESPÍRITO SANTO

CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS

DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA RURAL

ENGENHARIA DE ALIMENTOS

CAMILA PEREIRA FRACALOSSI

TRABALHO DE FÍSICO-QUÍMICA II

REAÇÕES ENZIMÁTICAS

ALEGRE

2010

Comentários