Manual de Analise Sanitaria de Sementes

Manual de Analise Sanitaria de Sementes

(Parte 1 de 5)

Anexo do Capítulo 9 (Teste de Sanidade de Sementes) das Regras para Análise de Sementes.

Manual de Análise Sanitária de Sementes

Brasília – 2009

© 2009 Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Todos os direitos reservados. Permitida a reprodução desde que citada a fonte. A responsabilidade pelos direitos autorais de textos e imagens desta obra é do autor. Título: Manual de Análise Sanitária de Sementes, Anexo do Capítulo 9 (Teste de Sanidade de Sementes) das Regras Para Análise de Sementes 1ª edição, 1ª reimpressão, revisada e atualizada. Ano 2009 Tiragem: 2. 500 exemplares

Elaboração, distribuição, informações: MINISTÉRIO DA AGRICULTURA, PECUÁRIA E ABASTECIMENTO Secretaria de Defesa Agropecuária - SDA Coordenação Geral de Apoio Laboratorial - CGAL Esplanada dos Ministérios, Bloco D, Anexo B, 4º andar, sala 430 CEP: 70043-900, Brasília - DF Tel.: (61) 3225-5098 Fax.: (61) 3218-2697 w.agricultura.gov.br e-mail: cgal@agricultura.gov.br Central de Relacionamento: 0800 704 1995

Coordenação Editorial: Assessoria de Comunicação Social Impresso no Brasil / Printed in Brazil

Catalogação na Fonte Biblioteca Nacional de Agricultura – BINAGRI

Brasil. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento.

Manual de Análise Sanitária de Sementes / Ministério da Agricultura,

Pecuária e Abastecimento. Secretaria de Defesa Agropecuária. – 1. ed., 1. reimpr. rev. e atual. – Brasília : Mapa/ACS, 2009. 200 p.

ISBN 978-85-99851-64-7

1. Semente. 2. Inspeção Sanitária. 3. Defesa Vegetal. 4. Análise de Risco. I. Secretaria Defesa Agropecuária. I. Título.

AGRIS F03 CDU 631.53.03

Ao Professor Dr. José da Cruz Machado, pela Coordenação Geral deste Manual e pelas relevantes informações técnicas cedidas ao Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento.

À todos os colaboradores, incluindo estudantes de graduação e pós-graduação do Departamento de Fitopatologia da Universidade Federal de Lavras.

NomeInstituição / SiglaE-mail

José da Cruz Machado - Coordenador Geral e Coordenador do capítulo sobre Fungos

Universidade Federal de Lavras - UFLAmachado@ufla.br

José Mauricio Pereira - Revisor Laboratório Oficial de Análise de Sementes/

Laboratório Nacional Agropecuário – LASO/ LANAGRO/MG jose.m.pereira@agricultura.gov.br

Luiz Artur Costa do ValleLaboratório Oficial de Análise de Sementes/

Laboratório Nacional Agropecuário – LASO/ LANAGRO/MG luiz.valle@agricultura.gov.br

Myriam A. G. Leal Alvisi -Coordenadora do Grupo I – Portaria nº 62 de 10/03/2006

Laboratório Oficial de Análise de Sementes/ Laboratório Nacional Agropecuário – LASO/ LANAGRO/MG myriam.alvisi@agricultura.gov.br

NomeInstituição / SiglaE-mail

Ademir Assis HenningEmpresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária

/ Centro Nacional de Pesquisa de Soja – Embrapa/SOJA henning@cnpso.embrapa.br

Andréa Bittencourt MouraUniversidade Federal de Pelotas - UFPELabmoura@ufpel.tche.br

Antônia dos Reis Figueira -Coordenadora do Capítulo sobre Vírus

Universidade Federal de Lavras - UFLAantonia@ufla.br

Carlos Mitinori UtiamadaTecnologia Agropecuária Ltda. TAGROcarlos.utiamada@tagro.com.br

Débora Cristina Santiago Coordenadora do capitulo sobre Nematóides

Universidade Estadual de Londrina - UELsantiago@uel.br

Ênia Mara de CarvalhoUniversidade Federal Rural do Rio de Janeiro - UFRRJ eniacarvalho@yahoo.com.br

Luiz Carlos Bhering NasserEmpresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária – Embrapa/Mapa luiz.nasser@agricultura.gov.br

Maria Heloisa Duarte de MoraisEscola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz – ESALQ / USP mhdmorae@esalq.usp.br

Nicésio F. de Almeida PintoEmpresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária/

Centro Nacional de Pesquisa de Milho e Sorgo – Embrapa/CNPMS nicesio@cnpms.embrapa.br

Ricardo Magela de Souza Coordenador do capítulo sobre Bactéria

Universidade Federal de Lavras - UFLArmagelas@ufla.br

1 INTRODUÇÃO9
2 GRUPOS DE PATÓGENOS EM RELAÇÃO AO TESTE DE SANIDADE1
3 FORMAS DE ASSOCIAÇÃO DE PATÓGENOS COM SEMENTES19
DE ANÁLISE DE SEMENTES23
4.1 Manuseio das amostras na recepção24
4.2 Destino de embalagens e outros materiais descartáveis24
4.3 Cuidados com as amostras após a recepção24
4.4 Manuseio de sementes tratadas com biocidas25
4.5 Técnicas auxiliares25
4.5.1 Limpeza e esterilização de material25
4.5.2 Preparo de material para exame microscópico26
5 TESTES DE SANIDADE27
5.1 MÉTODOS DE DETECÇÃO DE FUNGOS28
5.1.1 Inspeção visual da amostra de sementes28
5.1.2 Exame da suspensão de lavagem das sementes31
5.1.3 Incubação em Substrato de Papel ou método do Papel de Filtro (“blotter test”)3
5.1.4 Plaqueamento em meio ágar sólido (BDA ou MEA)34
5.1.5 Métodos específicos35
5.1.5.1 Incubação em Rolo de Papel36
5.1.5.2 Incubação em Meio Agar-Bromofenol NEON38
5.1.5.3 Fluorescência sob luz negra40
5.1.5.4 Incubação em Meio Agar Salino41
5.1.5.5 Exame de embrião para detecção de Ustilago sp em sementes de cereais43
5.1.5.6 Exame de marcadores moleculares4
‘INCUBAÇÃO EM SUBSTRATO DE PAPEL’45
5.2 MÉTODOS DE DETECÇÃO DE BACTÉRIAS102
5.2.1 Plantio de Sementes em Substrato Esterilizado102
5.2.2 Inoculação em plantas susceptíveis102
5.2.3 Plaqueamento em meio seletivo e semi-seletivo103
5.2.4 Registro de resultados103
5.2.5 Métodos específicos para cada espécie104
5.2.5.1 Detecção de Xanthomonas campestris pv. campestris em Brassica spp. (ISTA)104
5.2.5.2 Detecção de Xanthomonas hortorum pv. carotae em Daucus carota (ISTA)106
hirsutum L.)109
esculentum) – Workshop 1999112

SUMÁRIO 4 MANUSEIO DE AMOSTRAS DE SEMENTES E TÉCNICAS AUXILIARES EM LABORATÓRIO CARACTERISTICAS DOS FUNGOS EXIBIDAS EM SEMENTES PELO MÉTODO DE 5.2.5.3 Detecção de Xanthomonas axonopodis pv. malvacearum em algodão (Gossypium 5.2.5.4 Detecção de Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis em tomate (Lycopersicon 5.2.5.5 Detecção de Pseudomonas syringae pv. tomato em tomate (Lycopersicon esculentum) ...114

ISHI-Veg117
feijão ( Phaseolus vulgaris )119
Workshop 1999; Kobayasti, 2002122
5.3 MÉTODOS DE DETECÇÃO DE VÍRUS144
5.3.1. Testes biológicos144
5.3.2. Teste sorológico DAS-ELISA (Figuras 87-91)144
5.3.2.1. Extração do vírus145
5.3.2.2. Cobertura inicial das placas145
5.3.2.3. Adição da amostra145
5.3.2.4. Adição do Conjugado145
5.3.2.5. Adição do substrato e leitura dos resultados145
5.3.3. Diagnose de vírus através de PCR145
5.3.3.1. Extração do RNA total das sementes ou plântulas146
5.3.3.2. Transcrição reversa e PCR146
5.3.4 MÉTODOS ESPECÍFICOS POR ESPÉCIE152
5.3.4.1 Capsicum spp152
5.3.4.2 Cucumis melo/ Cucurbita sp161
5.3.4.3 Lactuca sativa166
5.3.4.4 Lycopersicon esculentum170
5.3.4.5 Phaseolus vulgaris173
5.4 MÉTODOS DE DETECÇÃO DE NEMATÓIDES177
5.4.1 Detecção de Heterodera glycines em amostras de sementes de soja178
Brachiaria180
Panicum181
5.4.4. Detecção de Aphelenchoides besseyi em sementes de arroz182
5.4.5 Detecção de Ditylenchus dipsaci em sementes de cebola183
5.4.6 TÉCNICAS MOLECULARES X NEMATÓIDES X SEMENTES184
5.4.7 TÉCNICA PARA QUANTIFICAÇÃO DOS NEMATÓIDES184
BIBLIOGRAFIA187

5.2.5.6 Detecção de Xanthomonas campestris pv. vesicatoria em tomate (Lycopersicon esculentum) - 5.2.5.7 Detecção de Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens em sementes de 5.2.5.8 Detecção de Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli em feijão (Phaseolus vulgaris) – 5.4.2 Detecção de Aphelenchoides besseyi e Ditylenchus dipsaci em amostras de sementes de 5.4.3 Detecção de Aphelenchoides besseyi e Ditylenchus dipsaci em amostras de sementes de ÍNDICE REMISSIVO .....................................................................................................................................193

O objetivo central deste manual é suprir o analista de laboratório com informações sobre os métodos mais comuns de detecção de fitopatógenos em sementes com protocolos simplificados e ilustrações fotográficas que visam facilitar as análises de rotina. Trata-se de uma publicação que complementa, na forma de anexo, o Capítulo 9, “Sanidade de Sementes”, das Regras para Análise de Sementes. A preocupação foi, portanto, disponibilizar ao sistema de controle de qualidade de sementes no país, um guia de consulta referencial, por ocasião das análises de rotina, procurando-se desta forma, cumprir os princípios de homogeneização e harmonização de informações neste tipo de atividade.

Por meio deste manual, o Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (Mapa), faz com que as regras e normas brasileiras para análises sanitárias de sementes sejam enquadradas o mais próximo possível nas regras internacionais prescritas pela ISTA (International Seed Testing Association), sendo adicionados alguns patossistemas de interesse no Brasil e que não são contemplados nas regras da referida Associação. A decisão de incluir métodos ainda não submetidos a testes comparativos de validação, conforme é a atual postura do Comitê de Sanidade de Sementes da ISTA em seu Manual de Sanidade, teve como base o fato de que a demanda pelo teste de sanidade de sementes para alguns patossistemas tem crescido rapidamente no Brasil e a eficácia desses métodos já têm sido comprovada de alguma forma.

O trabalho foi desenvolvido por um grupo de profissionais envolvidos com sanidade de sementes no Brasil, representando entidades públicas e privadas, pertencentes na sua maioria ao Comitê de Patologia de Sementes da ABRATES e sob a responsabilidade da CGAL/ Mapa.

As ilustrações e descrições de métodos foram fornecidos por profissionais que trabalham já por algum tempo no campo de controle de qualidade sanitária de sementes no país, e estes materiais permanecem sob o controle legal de propriedade de seus respectivos autores, o que faz com que a sua utilização para quaisquer outras finalidades, seja permitido somente mediante autorização expressa dos mesmos. Toda ilustração fotográfica contém uma indicação de autoria correspondente.

Embora esforços tenham sido feitos para tornar esta publicação a mais ampla possível, alguns patossistemas de importância para o Brasil, não foram incluídos nesta edição pela inexistência de informações e indisponibilidade de ilustrações adequadas dos mesmos. Na medida em que estas informações e material ilustrativo sejam disponibilizados, eles serão incorporados nas próximas Edições deste Manual.

Nesta primeira edição, foram considerados, portanto, somente os patossistemas que são de maior interesse e importância atual no Brasil.

As sementes de modo geral podem abrigar e transportar microrganismos ou agentes patogênicos de todos os grupos taxonômicos, causadores e não causadores de doenças. Do ponto de vista ecológico, esses agentes podem ser agrupados em organismos de campo, onde predominam espécies fitopatogênicas, e organismos de armazenamento, com pequeno número de espécies que deterioram as sementes nesta fase.

Os fungos englobam o maior número de espécies associadas às sementes, seguidos pelas bactérias, com um número expressivo de representantes e os vírus e nematóides, em menor número. Dentre os fungos fitopatogênicos, a maioria pode ser transmitida pelas sementes de seus hospedeiros.

2.1 Grupos de fungos associados às sementes

O agrupamento dos fungos, para efeito de entendimento e seleção de métodos de detecção em sementes pode ser realizado de forma simplificada tomando se como base a natureza de parasitismo destes organismos, biotróficos e necrotróficos. A classificação taxonômica clássica e moderna torna-se também de grande valor, posto que os métodos de detecção dos fungos mantém uma certa correlação com os grupos distinguidos pelas características que os marcam nestas classificações. Os agrupamentos com base em características morfológicas, como tipo de frutificação, tamanho, forma e cor de esporos e outras propriedades são importantes para a identificação desses organismos por ocasião de uma análise sanitária. A Divisão informal dos fungos nos dois grandes grupos, tendo se como referencial a natureza do parasitismo (Tabela 1), é importante, pelo fato de que os fungos biotróficos não completam seu ciclo biológico em condições artificiais, e isto faz com que estruturas típicas que os caracterizam não sejam formadas em testes de sanidade que empregam métodos artificiais que induzem a formação destas estruturas. Por sua vez, as espécies necrotróficas, que englobam a maioria das espécies associadas às sementes, podem ser mais facilmente reconhecidas nessas condições, posto que podem completar seu ciclo biológico parcial ou completo, formando estruturas típicas que podem ser reconhecidas com auxilio de microscópios. Para algumas espécies necrotróficas, de crescimento lento ou em casos de espécies que dificilmente produzem frutificações na maior parte de seu ciclo biológico, é necessário que métodos específicos ou especiais sejam desenvolvidos.

A classificação dos fungos com base em: (1) caráter de evolução, (2) características morfológicas e, (3) processos de divisão celular, mitospórico e meióspórico tornam-se também, de certa forma, de grande valor para o analista dando lhe segurança no exame das sementes. O conhecimento das estruturas dos fungos em seu ciclo biológico é, portanto, um requisito indispensável por parte dos analistas. Conceituação e descrições detalhadas de estruturas fúngicas como, acérvulos, picnídios, esporodóquios, sinêmios, clamidósporos, escleródios ou esclerócios, peritécios, além dos diferentes tipos de esporos/conídios, podem ser encontrados em livros textos especializados, devendo ser consultados constantemente pelos analistas e demais profissionais ligados a análise sanitária de sementes, em casos de dúvidas.

Marcadores fisiológicos, bioquímicos e moleculares, constituem modernamente a base do desenvolvimento de alguns métodos de detecção de fungos, facilitando e conferindo segurança aos testes de sanidade para inúmeras espécies.

Tabela

Classificação genérica dos fungos mais comumente associados às sementes de espécies hospedeiras de importância agrícola

Scler ospora PlasmoparaPer onospora

OomycotaInferiores

T illetiaUstilagoBasidiomycotina Superiores

RhizopusInferiores

Scler otinia

Mycosphaer ella

Nectria

Glomer ellaGiber ella DydimellaCochliobolus

Ascomycotina*/mitospóricos Superiores

V erticilliumAcr emonium PenicilliumAsper gillus

Scler otinia

Colletotrichum GerlachiaFusarium

StagonosporaStrnocarpella PhomopsisPhomaMacr ophomina

Botryodiplodia

Ascochyta

Cer cospora PyriculariaT richoconiellaDr echsleraBipolarisAlternaria

Thanathephorus (Rhizoctonia)Basidiomycotina

2.2 Grupos de bactérias associados às sementes

A maioria das bactérias fitopatogênicas é do tipo bastonete e não forma esporos ou quaisquer outras estruturas de resistência ou de repouso. O tamanho da célula bacteriana é variável, apresentando em média 1,0–5,0 x 0,5-1,0mm. A reprodução das bactérias fitopatogênicas ocorre por fissão binária ou divisão simples a uma taxa espantosamente rápida. Sob condições favoráveis, o período de geração, isto é, o tempo que uma bactéria leva para originar duas células filhas, varia de 20 a 50 minutos. Após a divisão as células são independentes, não formam tecidos e apresentam forte afinidade por água. Quando uma única célula bacteriana é depositada sobre a superfície de um meio de cultura sólido ela pode se multiplicar, dando origem a uma massa de células visíveis chamada de colônia. Colônias de diferentes espécies podem variar no diâmetro, desde frações de milímetro (Xylella) até alguns centímetros (Erwinia) e na forma, circulares, ovais ou irregulares. Suas bordas podem ser lisas, onduladas ou irregulares. Colônias de muitas espécies são esbranquiçadas ou cinzas (ex: Pseudomonas), enquanto outras são amarelas (Xanthomonas e Clavibacter). Algumas produzem pigmentos fluorescentes sob luz ultravioleta (Pseudomonas syringae pv. tomato), ou marrom (isolados de Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli) difusíveis no meio agar. Essas características permitem o desenvolvimento de métodos de detecção baseados na extração da bactéria pela imersão das sementes em tampão fosfato salina e posterior plaqueamento, ou mesmo o semeio direto da semente, em meio de cultura seletivo.

As bactérias podem sobreviver nas sementes, como latente, em baixas populações tendo sua multiplicação paralisada. A semente infectada pode ou não apresentar sintomas, na maioria das vezes não apresenta. Neste caso, se as sementes forem postas para germinar em substrato esterilizado (areia, vermiculita, solo e outros) de forma individualizada e mantidas em casa de vegetação ou câmara de crescimento, a partir da emergência das plântulas, poderá se observar a ocorrência de sintomas característicos da infecção pelo patógeno alvo. Então, é realizado o isolamento da bactéria e sua posterior identificação. Este também pode ser um método de detecção de bactérias em sementes, com a vantagem de permitir a determinação da porcentagem de transmissão do patógeno; entretanto, não permite a detecção de bactérias em sementes não germinadas.

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