Atividade enzimática, Trabalhos de Engenharia Madeireira

Baixe Atividade enzimática e outras Trabalhos em PDF para Engenharia Madeireira, somente na Docsity! ATIVIDADE ENZIMÁTICA 1 OBJETIVO Compreender os significados bioquímicos da Constante de Michaelis-Menten e avaliar a atividade enzimática das enzimas bromelina e amilase em diferentes meios. 2 INTRODUÇÃO O Trabalho Acadêmico a ser apresentado é uma análise de dois experimentos: O primeiro estudado apenas teoricamente; E o segundo executado no laboratório de Química, no dia 21/05/2010, orientados pela professora Rosemary Pimentel. 3 REVISÃO DE LITERATURA Os organismos vivos são formados por coleções de moléculas inanimadas que interagem entre si. O objetivo básico da Bioquímica é mostrar como essas coleções de moléculas inanimadas interagem entre si, mantendo e perpetuando os organismos vivos(animados), através da químicas aplicada a um nível molecular. Para a Bioquímica, todos os organismos vivos(animados) são semelhantes em níveis moleculares e químicos. Assim, ela descreve as estruturas, mecanismos e processos químicos compartilhado por todos os seres existentes (inanimados e animados), comparando-os em termos moleculares, formulando princípios organizacionais que fundamentam a Lógica Molecular da Vida. Um dos princípios organizacionais da Bioquímica é a hierarquia molecular. Os seres vivos são constituídos por células com diferentes funções. Todas as células, por sua vez, possuem uma estrutura hierárquica semelhante: As células são divididas em complexos supramoleculares; Estes complexos são subdivididos em macromoléculas constituídas de biomoléculas, formadas a partir de subunidades monoméricas. Existem quatro principais grupos de macromoléculas: Lipídios, carboidratos, ácidos nucléicos e proteínas. “As proteínas são as macromoléculas mais abundantes nas células vivas. Elas ocorrem em todas as células e em todas as partes destas. As proteínas também ocorrem 1 em grande variedade; [...] as proteínas também exibem uma grande diversidade de funções biológicas, sendo os produtos finais mais importantes das vias de informação [...]. Em um sentido, são os instrumentos moleculares por meio dos quais a informação genética é expressa.” (LEIHNINGER, 2002. p. 89) Dentre tantos papéis desempenhados pela proteína, encontra-se o de catálise. A catálise é a capacidade que um composto tem de acelerar uma reação num determinado substrato (“fonte de alimentação” da reação). As moléculas de proteínas que atuam como catalisadoras são chamadas de enzimas, ou biocatalisadores. A atividade enzimática foi estudada por Leonor Michaelis e Maus Menten, em 1913, dividindo o processo em duas etapas que podem ser descritas conforme a equação a seguir: “[...] inicialmente a enzima se combina reversivelmente com o substrato para formar o complexo enzima- substrato, em um passo reversível relativamente rápido. [...] Em uma segunda etapa lenta, o complexo ES então se quebra liberando a enzima livre, o produto da reação, P. [...]” (LEIHNINGER, 2002. p. 199) Além de estudar o processo envolvido durante a reação, Michaelis e Menten criaram uma constante combinando: A velocidade inicial e máxima de conversão do substrato em produto; a concentração de enzima; e a concentração do substrato na solução. Ou seja: Quando a concentração do substrato alcança a metade da velocidade máxima, encontramos a constante. Vale ressaltar que a constante de Michaelis-Menten tem como papel fundamental prever a quantidade de substrato e enzima para que a reação seja eficaz. Abaixo, segue a fórmula matemática da constante: Km = (1) Km: Constante de Michaelis-Menten; k1: Enzima e Substrato formando Complexo Enzima-Substrato; k2: Complexo Enzima-Substrato formando Enzima e Produto; k3: Reação reversível Complexo Enzima-Substrato formando Enzima e Substrato. Após observar as etapas da atividade enzimática, Michaelis e Menten criaram gráficos para identificar a posição da constante: 2 4.1.3 Procedimento Experimental I) Extração da enzima • Transferir 4 g de fermento de panificação para tubo de centrífuga, adicionar 20 mL de água destilada e deixar em estufa a 37oC por 30 minutos agitando casualmente. Centrifugar a 1.000 x g por 15 minutos recolhendo o sobrenadante que contém a enzima invertase. Fazer uma diluição de 1:100 ou 1:200 (a critério do professor). II) Ensaio enzimático • Pipetar os volumes (em mL) das soluções em 8 tubos de ensaio, enumerados de 0 a 7, conforme indica o quadro que se segue: Tubo 0 1 2 3 4 5 6 7 Sacarose 12,5mM 0,0 0,4 0,8 1,2 1,6 2,0 2,0 2,5mL de padrão contendo 100ug de glicoseÁgua 2,0 1,6 1,2 0,8 0,4 0,0 0,5 Invertase Diluída 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 TABELA1: VALORES DE CONCENTRAÇÕES PARA AS SOLUÇÕES • Incubar os tubos (exceto o tubo no 7) a 37oC, por 15 minutos, para que a invertase catalise a hidrólise da sacarose, resultando na formação de glicose e frutose (açúcares redutores), os quais podem ser determinados pela reação de Somogyi-Nelson. III) Reação para dosagem de açúcares redutores. • Após o período de incubação acrescentar 1 mL do reativo de Somogy (a reação enzimática é paralisada pela desnaturação da invertase, quer pela ação do Cu++ ou pela alcalinidade do reagente). • Ferver os tubos em banho-maria por 10 minutos, resfriá-los e juntar 1 mL do reativo de Nelson. • Agitar, completar o volume a 10 mL (adicionando 5,5 mL de água destilada), agitar novamente a fazer leitura a 530 nm. • Registrar suas observações. TUBO (NO) T% 530 nm D.O. 530 nm D.O. 530 nm [S]* V** 1 [S] 1 V 0 0 mM — 1 2 mM 0,500 2 4 mM 0,250 5 3 6 mM 0,167 4 8 mM 0,125 5 10 mM 0,100 6 — — — — 7 — — — — TABELA 2: REGISTROS 4.2 RESULTADOS E DISCUSSÃO I. Preencher a tabela. Por conta da ausência do espectrofotômetro, não foi possível encontrar os valores de Transmitância, Densidade Ótica e, consequentemente, de velocidade. II. Transformar as leituras de densidade ótica em quantidades de açúcar redutor. As quantidades de açúcares redutores dependem do valor das densidades óticas, os quais não foram encontrados por carência do Espectrofotômetro. III. Calcular as velocidades de reação V para cada tubo. Com os dados construir os seus gráficos V em função de [S] e 1/V em função de 1/[S]. Não foi possível quantizar os valores de velocidade, pois o experimento não foi realizado na prática. Mas a teoria mostra que os gráficos V x [S] e 1/V x 1/[S] ficariam da seguinte maneira: V x [S] 1/V x 1/[S] IV. Determinar analiticamente os valores de Km e Vmáx e discutir os seus significados bioquímicos. A constante de Michaelis-Menten (Km) é a concentração do substrato quando a velocidade atinge metade de seu valor máximo. Não foi possível quantizar os valores de velocidade, pois o experimento não foi realizado na prática, consequentemente, o valor de Km também não foi encontrado. Km sempre assume um valor entre 0 e 1; Quanto mais próximo de 0 for Km, mais eficaz é a afinidade das enzimas com o substrato, logo, o tempo da reação é melhor aproveitado e o desperdício de substrato é menor. 6 V. Explique o que ocorre nos tubos 0 e 6 comparando os resultados obtidos no experimentos. O experimento não foi realizado na prática, por isso não foi possível observar o que ocorreria com os tubos. 5 EXPERIMENTO 2: AÇÃO ENZIMÁTICA EM CARBOIDRATOS E PROTEÍNAS 5.1 MATERIAL E MÉTODOS 5.1.1 Equipamentos e vidrarias • Erlenmeyer; • Tubos de ensaio; • Pipeta volumétrica; • Béquer; • Espátula; • Vidro de relógio; • Funil; 5.1.2 Reagentes • Folha de gelatina incolor (2cm²); • Pedaços de papel crepom; • Solução de Maisena; • Extrato de abacaxi; • Saliva; • Bicarbonato; • Vinagre; • Água destilada. 5.1.3 Procedimento Experimental I) Preparou-se as fontes de enzimas • Liquidificou-se quatro fatias de abacaxi, congelou-se e descongelou-se a polpa e filtrou-se 5ml do extrato em papel de filtro; 7