Farmacologia das infecções bacterianas: replicação, transcrição e tradução do dna

Farmacologia das infecções bacterianas: replicação, transcrição e tradução do dna

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Farmacologia das Infecções Bacterianas: Replicação, Transcrição e Tradução do DNA

Marvin Ryou e Donald M. Coen

Introdução Caso Bioquímica da Replicação, Transcrição e Tradução do DNA

Procariótico Estrutura do DNA Replicação e Segregação do DNA e Topoisomerases Transcrição Bacteriana Síntese de Proteínas Bacterianas Classes e Agentes Farmacológicos

Inibidores das Topoisomerases: Quinolonas Inibidores da Transcrição: Derivados da Rifamicina Inibidores da Tradução

Agentes Antimicrobianos Dirigidos Contra a Subunidade

Agentes Antimicrobianos Dirigidos Contra a Subunidade

Conclusão e Perspectivas Futuras Leituras Sugeridas

As diferenças bioquímicas fundamentais observadas entre as bactérias e os seres humanos são exploradas no desenvolvimento e uso clínico de antibióticos. Os processos do dogma central — replicação, transcrição e tradução do DNA — compartilham muitas semelhanças entre bactérias e seres humanos. Entretanto, existem diferenças importantes na bioquímica dos processos do dogma central dos procariotas (i. é, bactérias), em comparação com aqueles dos eucariotas (i. é, seres humanos). Três dessas diferenças são utilizadas como alvos pelos agentes quimioterápicos antibacterianos: (1) as topoisomerases, que regulam o superenrolamento do DNA e medeiam a segregação das fitas replicadas de DNA; (2) as RNA polimerases, que transcrevem o DNA em RNA; e (3) os ribossomos, que traduzem o RNA mensageiro (mRNA) em proteína.

Os antibióticos quinolonas são agentes de amplo espectro; não apenas inibem certas topoisomerases, como também convertem essas enzimas em agentes que provocam lesão do DNA. Os derivados da rifamicina ligam-se à RNA polimerase bacteriana e a inibem. (Um desses derivados, a rifampicina, constitui a base do tratamento da tuberculose.) Diversos fármacos ligam-se aos ribossomos bacterianos, inibindo a síntese de proteína. Especificamente, os aminoglicosídios, as tetraciclinas e as espectinomicinas ligam-se à subunidade ribossomal 30S, enquanto os macrolídios, o cloranfenicol, as lincosamidas, as estreptograminas e as oxazolidinonas têm como alvo a subunidade ribossomal 50S. Em geral, esses inibidores da síntese de proteínas atuam sobre microrganismos tanto Gram-positivos quanto Gram-negativos e, portanto, têm ampla aplicação clínica

(ver Cap. 3 para uma discussão das bactérias Gram-positivas e Gram-negativas). Este capítulo procede a uma revisão sucinta da bioquímica dos processos do dogma central nos procariotas e analisa certas diferenças relevantes entre esses processos nos procariotas e eucariotas. A partir dessa base, o capítulo discute os mecanismos pelos quais os inibidores farmacológicos interrompem a replicação, a transcrição e a tradução do DNA bacteriano.

n Caso

Verão de 1976. Os participantes de uma convenção dos Legionários Americanos, em Philadelphia, ficam gravemente doentes com um tipo misterioso de pneumonia. O surto ocorre no Bellevue Stratford Hotel, onde 150 hóspedes e 32 visitantes contraem a “doença dos Legionários”. A doença leva 29 vítimas à morte. As colorações convencionais para escarro, as culturas e até mesmo as amostras de necropsia não revelam nenhum patógeno consistente. O terror de uma doença epidêmica desconhecida espalha rumores e relatos inéditos de gases venenosos, suprimentos contaminados de água, terrorismo e vírus mortíferos.

Vários meses depois, equipes de pesquisa laboratoriais e de campo dos Centers for Disease Control and Prevention (Centros para Controle de Doença e Prevenção) (CDC) identificam a bactéria Gram-negativa aeróbica causal e a denominam Legionella pneumophila. Observa-se que os casos tratados com eritromicina e tetraciclina apresentam melhores desfechos do que aqueles tratados com outros fármacos. Hoje em dia, a eritromicina e outros macrolídios, a claritromicina e a azitromicina, são freqüentemente utilizados no tratamento da doença dos Legionários, bem como

548 | Capítulo Trinta e Dois no tratamento de muitas infecções por clamídias, estreptococos e estafilococos.

n 1. Quais as etapas no processo de tradução que são bloqueadas pelas tetraciclinas e pelos macrolídios? n 2. Como as bactérias desenvolvem resistência a esses fármacos e a outros inibidores da transcrição e tradução? n 3. Por que os macrolídios são bacteriostáticos, enquanto alguns antibióticos, como as quinolonas e os aminoglicosídios, são bactericidas? n 4. Por que os macrolídios constituem um tratamento efetivo na doença dos Legionários?

O dogma central da biologia molecular começa com a estrutura do DNA, a macromolécula que transporta a informação genética. Para transmitir toda a informação genética de uma célula para duas células-filhas, o DNA parental precisa ser copiado em sua totalidade (replicação), e as duas cópias resultantes devem ser segregadas — uma cópia para cada célula-filha. Para expressar os genes que se encontram no DNA, essas porções específicas do DNA são copiadas (transcrição) em RNA. A seguir, ocorre leitura de alguns RNA (mRNA) (tradução) pela maquinaria de síntese protéica para a produção de proteínas. Outros RNA, como o RNA de transferência (tRNA) e o RNA ribossomal (rRNA), desempenham funções complexas, que são essenciais à síntese de proteínas. A discussão que se segue sobre esses processos procarióticos é simplificada para ressaltar as etapas que são inibidas pelos antibióticos.

O DNA é constituído de duas fitas de desoxirribonucleotídios polimerizados que se enrolam um ao redor do outro em uma conformação de “dupla hélice”. O grupo 5 -hidroxila de cada anel desoxirribose do nucleotídio liga-se, através de um grupo fosfato, ao grupo 3 -hidroxila do nucleotídio seguinte, formando, assim, o arcabouço fosfodiéster de cada lado da “escada” dupla helicoidal (Figs. 32.1 e 32.2). As purinas adenina (A) e guanina (G) e as pirimidinas timina (T) e citosina (C), que estão ligadas de modo covalente ao anel de desoxirribose, associam-se entre si (A com T, G com C) através de pontes de hidrogênio, formando os “degraus” da escada (Fig. 32.2). É a seqüência linear de bases que codifica a informação genética de uma célula. O Cap. 37 procede a uma revisão do processo de síntese dos precursores nucleotídicos dessas bases. A estrutura do DNA é essencialmente a mesma nos procariotas e nos eucariotas. Todavia, os cromossomos procarióticos consistem, habitualmente, em DNA circular, enquanto os cromossomos eucarióticos, incluindo os dos seres humanos, consistem em moléculas lineares.

A replicação exata e a segregação do DNA bacteriano para as células-filhas envolvem numerosas etapas, muitas das quais podem constituir alvos apropriados para agentes antibacterianos. Até o momento, as enzimas nesse processo que têm sido utilizadas como alvo com maior sucesso são as topoisomerases. Essas enzimas desempenham diversas funções durante a replicação e a segregação do DNA.

Durante a replicação do DNA, as fitas complementares de DNA são sintetizadas de modo bidirecional, formando as denominadas duas forquilhas de replicação. Para iniciar esse processo, as duas fitas de DNA que compõem a dupla hélice devem se desenrolar e se separar. Ao fazê-lo, as fitas de DNA formam “superenrolamentos”, em que o polímero helicoidal sofre superenrolamento à medida que gira na mesma direção da volta da hélice. (Esse processo assemelha-se ao que ocorre com os fios de telefone durante o seu uso.) Os superenrolamentos aumentam a tensão nas fitas de DNA e, portanto, interferem no desenrolamento adicional. Na ausência de um processo para aliviar a tensão criada pelos superenrolamentos, todo o cromossomo deveria girar; esse processo seria complexo e iria consumir energia, podendo emaranhar toda a molécula.

Quando a replicação do DNA é concluída, as duas cópias filhas de DNA enrolam-se uma em torno da outra. Nas bactérias, como os cromossomos são circulares, as cópias filhas enlaçadas formam anéis entrelaçados (catenanos). Esses anéis entrelaçados devem ser separados (resolvidos) antes de sua segregação para as células-filhas.

As topoisomerases desempenham ambas as funções — remoção do excesso de superenrolamento do DNA durante a sua replicação e separação do DNA filho entrelaçado. As topoisomerases catalisam essas atividades através de ruptura,

Base nitrogenada O

Base nitrogenada O

Base nitrogenada Extremidade 5'

Extremidade 3' β-D-2-desoxirribose

Fig. 32.1 Estrutura do arcabouço do DNA. O DNA é um polímero de nucleotídios em que uma ligação fosfodiéster une os açúcares 2 desoxirribose de cada nucleotídio vizinho. A ligação fosfodiéster liga 3 -OH de uma desoxirribose a 5 -OH da desoxirribose seguinte, formando, assim, o arcabouço da fita de DNA.

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rotação e religação das fitas de DNA. Existem dois tipos de topoisomerases. As topoisomerases tipo I formam e reúnem quebras de fita simples no DNA, diminuindo o superenrolamento positivo (Fig. 32.3). As topoisomerases tipo I executam essas funções de nuclease e ligase em ambas as fitas de DNA (Fig. 32.4). Ambos os tipos de topoisomerases podem remover o excesso de superenrolamento do DNA durante a sua replicação. Entretanto, apenas as topoisomerases tipo I podem resol- ver as cópias entrelaçadas de DNA de fita dupla para permitir a segregação do DNA nas células-filhas. As enzimas do tipo I são mais complexas e mais versáteis do que as topoisomerases do tipo I, e a enzima do tipo I é utilizada como alvo molecular mais freqüente para agentes quimioterápicos.

O mecanismo de ação da topoisomerase tipo I ocorre em duas etapas. Em primeiro lugar, a enzima liga-se a um segmento de DNA e forma ligações covalentes com fosfatos de cada fita, cortando, assim, ambas as fitas. Em segundo lugar, a enzima produz estiramento do DNA da mesma molécula para passar através da quebra, aliviando o superenrolamento (Fig. 32.4). Essa passagem de DNA de fita dupla através de uma quebra de fita dupla é que permite a separação das cópias entrelaçadas de DNA após a replicação e, portanto, a segregação do DNA nas células-filhas.

Existem duas topoisomerases do tipo I bacterianas principais. A primeira a ser identificada, a DNA girase, é uma topoisomerase tipo I bacteriana que é incomum pela sua capacidade de introduzir superenrolamentos negativos antes da separação das fitas de DNA, neutralizando, assim, os superenrolamentos positivos que se formam à medida que as fitas se desenrolam. A segunda topoisomerase tipo I principal é a topoisomerase IV. A DNA girase é particularmente crucial para a segregação em algumas bactérias, enquanto a topoisomerase IV é a enzima crítica em outras bactérias.

Como o superenrolamento é importante tanto para a transcrição quanto para a segregação, as topoisomerases também influenciam esse processo do dogma central. Em virtude de suas múltiplas funções, as topoisomerases estão habitualmente envolvidas com o DNA, e esse aspecto é importante para o seu papel como alvo de fármacos. Essas enzimas não apenas são importantes como alvos de agentes antibacterianos, mas também como alvos para a quimioterapia do câncer (ver Cap. 37).

A expressão gênica começa com uma transcrição, que envolve a síntese de transcritos de RNA de fitas simples a partir de um molde de DNA. A transcrição é catalisada pela enzima RNA polimerase. Nas bactérias, cinco subunidades (2 , 1 , 1 e 1 ) associam-se para formar a holoenzima. Conforme discutido adiante, a subunidade é fundamental para iniciar a transcrição, enquanto o restante da enzima RNA polimera se — também conhecida como enzima cerne — contém o mecanismo catalítico para a síntese de RNA.

O processo de transcrição ocorre em três estágios: iniciação, alongamento e término (Fig. 32.5). Durante a iniciação, a holoenzima, a RNA polimerase, separa as fitas de um segmento curto do DNA de dupla hélice após o reconhecimento de um sítio proximal pela sua subunidade . Uma vez desenrolada a dupla hélice para formar um molde de fita simples, a RNA polimerase inicia a síntese de RNA em um ponto de iniciação no DNA. Durante o alongamento, a RNA polimerase sintetiza uma fita de RNA complementar, unindo os trifosfatos de ribonucleosídio através de ligações fosfodiéster. No processo, a subunidade dissocia-se da holoenzima. A síntese de RNA prossegue na direção 5 →3 , de modo que a fita de RNA nascente emerge da enzima até atingir uma seqüência de término.

A enzima RNA polimerase difere entre bactérias e seres humanos e, portanto, pode servir de alvo seletivo para a ação de agentes antibacterianos. Nas bactérias, uma RNA polimerase sintetiza todo o RNA na célula (à exceção dos primers de RNA curtos necessários para a replicação do DNA, que desoxirribosedesoxirribose

N desoxirribose

O desoxirriboseH

Adenina Timina

Guanina Citosina base aseO HO b se

Fig. 32.2 Pontes de hidrogênio entre fitas de DNA. A e B. As linhas tracejadas indicam pontes de hidrogênio entre bases complementares em fitas de DNA opostas. A adenina (A) e a timina (T) formam duas pontes de hidrogênio, enquanto a guanina (G) e a citosina (C) formam três pontes de hidrogênio. C. Esses pares de bases A−T e G−C formam os “degraus da escada” de dupla hélice do DNA. Observe que os componentes de desoxirribose e as ligações fosfodiéster estão localizados fora da dupla hélice de DNA, enquanto as bases purinas e pirimidinas encontram-se no centro da molécula de DNA.

550 | Capítulo Trinta e Dois

Mecanismo de rotação da fita

Ligação Topoisomerase tipo I

Quebra Rotação Quebra

Rotação

Junção Passagem Camptotecinas Junção

Ligação Fusão

Mecanismo de passagem da fita

Fig. 32.3 Regulação do superenrolamento do DNA pelas topoisomerases tipo I. Foram propostos dois mecanismos para a ação das topoisomerases tipo I. No modelo de rotação da fita, a topoisomerase tipo I liga-se às fitas opostas da dupla-hélice de DNA. A seguir, a topoisomerase rompe uma fita e permanece ligada a uma das extremidades rompidas (círculo cinza cheio). A extremidade não ligada da fita rompida pode desenrolar-se em uma ou mais voltas e, a seguir, unir-se (religar-se) à fita parental. No modelo de passagem da fita, a ligação da topoisomerase tipo I à dupla-hélice do DNA resulta em fusão (separação) das duas fitas de DNA. A seguir, a topoisomerase ligada ao DNA introduz uma ruptura em uma fita, enquanto permanece ligada a cada extremidade da fita de RNA rompida (círculos azuis cheios). A seguir, a fita rompida passa através da hélice e é unida (religada), resultando no desenrolamento efetivo do DNA. As camptotecinas, que são utilizadas na quimioterapia do câncer (ver Cap. 37), inibem a junção da fita quebrada do DNA após a passagem da fita.

Segmento G

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