Apostila Análise microbiológica da água (Decreto-lei 243/2001; anexo III)

Apostila Análise microbiológica da água (Decreto-lei 243/2001; anexo III)

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3 MICROBIOLOGIA AMBIENTAL APLICADA1

3.1 Análise microbiológica da água (Decreto-lei 243/2001; anexo I)

Objectivos (1) Determinar os principais parâmetros microbiológicos de qualidade da água; (2) Executar a técnica da inoculação de tubos múltiplos e da quantificação indirecta de microrganismos coliformes pelo método do número mais provável (NMP); (3) Comparar os resultados obtidos com a legislação actual e criticar a qualidade sanitária da amostra de água analisada.

Introdução As fontes de água potável estão sujeitas a contaminações por matéria fecal dos esgotos ou de outra origem, podendo provocar infecções intestinais como febre tifóide, disenteria e cólera. A identificação das bactérias patogénicas constituiria a prova mais directa de uma contaminação perigosa, mas tais organismos, quando presentes, encontram-se geralmente em tão escasso número que as dificuldades técnicas do seu isolamento tornam o ensaio impraticável como método de rotina. Assim, fazem-se pesquisas de microrganismos (ou grupos de microrganismos) denominados “indicadores” de contaminação da água por fezes humanas ou de outros animais (bactérias entéricas, bactérias coliformes, bactérias fecais).

A análise bacteriológica da água não é feita apenas a águas que se destinam ao consumo das populações, mas também a águas destinadas ao recreio (praias, rios, piscinas, etc.), à aquacultura e à rega. É igualmente importante, numa perspectiva de preservação dos ecossistemas, vigiar a qualidade das águas que não têm uma utilização especificamente humana.

O processo de rotina consta de contagens em placa para determinar o número de bactérias presentes, testes para revelar a presença de bactérias coliformes e testes para revelar a presença de estreptococos fecais. As bactérias coliformes são indicadoras de poluição fecal e incluem bastonetes Gram-negativos, aeróbios ou anaeróbios facultativos que não formam esporos e fermentam lactose com produção de ácido e gás em 48 horas e a uma temperatura de 37º C, na presença de sais de bílis. Como exemplo, citam-se Escherichia coli, Enterobacter aerogenes e Klebsiella pneumoniae.

O grupo dos microrganismos denominados "coliformes totais" inclui todos os coliformes específicos e não específicos do material fecal. É um bom indicador microbiológico da qualidade da água, porque é facilmente detectável e quantificável. A ausência de coliformes totais numa água potável garante a sua pureza bacteriológica. A sua presença pressupõe que o tratamento da água foi inadequado ou que a rede de distribuição não é estanque e foi contaminada por águas residuais. A tecnologia actual do tratamento de águas permite, através do controlo cuidado da coagulação, sedimentação e filtração, que mais de 9% dos coliformes sejam removidos.

1 Modificado de: (1) GALHANO, C., DUARTE, I. & ABELHO, M. Trabalhos práticos de Biologia – módulo

Microbiologia, 2007/2008. ESAC, Coimbra. 2007; (2) GRUPO DE APÓIO À COMUNIDADE - MICROBIOLOGIA E PARASITOLOGIA. Análise microbiológica da água, ESAC, 2005; (3) GAMAZO, C., LÓPEZ-GOÑI, I. & DÍAZ, R. Manual práctico de microbiología. 3ª edição, Masson, Barcelona. 2005; (2) PEPPER, I.L. & GERBA, C.P. Environmental microbiology – a laboratory manual. 2ª edição, Elsevier Academic Press, Amsterdão, 2004.

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O grupo de microrganismos denominados "coliformes fecais" é um subgrupo do anterior. Permite estabelecer uma correlação mais precisa entre a existência de coliformes numa amostra de água e a entidade responsável pela sua libertação, que terá sido um organismo homeotérmico. De entre os coliformes que existem nas fezes de animais homeotérmicos, mais de 90% são coliformes fecais. Estes coliformes fermentam a lactose com produção de ácido e gás a 44ºC.

É conveniente pesquisar também a existência de estreptococos fecais. A ocorrência destes indica que houve contaminação fecal. Embora raramente se multipliquem na água são capazes de persistir por longos períodos de tempo, desde que a temperatura e a concentração hidrogeniónica sejam favoráveis. São muito resistentes, suportando concentrações relativamente altas de cloro. Exemplos deste grupo são Streptococcus durans e S. fecalis (homem) e S. faecium (vaca e ovelha). Os estreptococos são cocos, Gram-positivos e dão resposta negativa ao teste da catalase.

A determinação do número total de microrganismos vivos na água constitui uma prova complementar (embora de limitado valor quando isolada), que fornece indicações quanto ao teor e natureza da matéria orgânica da amostra. O teste é realizado a 22ºC e a 37ºC em caixas de Petri inoculadas por incorporação. Determina-se assim o número de bactérias mesófilas, heterotróficas, aeróbias e anaeróbias não estritas.

3.1.1 RECOLHA DE AMOSTRAS DE ÁGUA PARA ANÁLISE MICROBIOLÓGICA

As mãos e a roupa dos intervenientes na colheita devem estar limpas. Os recipientes para colheita das amostras de água devem estar esterilizados. A amostra de água deve ser colhida obedecendo aos cuidados de assepsia, deve ser representativa das características microbiológicas do material a analisar e deve ter volume suficiente para permitir, se necessário, a repetição dos testes (i.e. 500 mL). O recipiente (esterilizado) para a amostra deve permanecer fechado até ao momento da colheita; nessa altura enche-se sem enxaguar com a água a analisar e fecha-se imediatamente, tendo cuidado para não contaminar durante estas operações as superfícies interiores da rolha ou tampa. O frasco não deve ficar completamente cheio, pois algum espaço vazio no seu interior facilitará a agitação e mistura da amostra antes de se efectuarem as análises. Após a colheita, os recipientes devem ser mantidos numa mala térmica para que a amostra não sofra alterações relativamente ao seu conteúdo microbiológico.

Material e métodos RECOLHA DE AMOSTRAS DE ÁGUA DE UMA TORNEIRA

1. Lavar e desinfectar as mãos (ou usar luvas) 2. Retirar qualquer filtro (Figura 1, 1) e deixar correr o tempo necessário (1-2 minutos) para esgotar a água que tenha estado parada na canalização (Figura 1, 2) 4. Fechar a torneira e flamejar bem (no interior e no exterior) com um maçarico ou uma tocha embebida em álcool (Figura 1, 3) 5. Abrir a torneira com cuidado e deixar a água correr de novo até arrefecer (Figura 1, 4) 6. Abrir o frasco esterilizado só neste momento e colher a água mantendo-o inclinado para evitar a sua contaminação pelo ar. Manter a rolha na mão esquerda virada para baixo e nunca tocar no interior da rolha ou no gargalo do frasco (Figura 1, 5) 7. Recolher a amostra de água mantendo o frasco inclinado para evitar a sua contaminação pelo ar e sem encher completamente o frasco (Figura 1, 6) 8. Fechar imediatamente o frasco (Figura 1,7)

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9. Colocar um rótulo que contenha a identificação da amostra: nome do requisitante; origem; ponto de amostragem e data de colheita 10. Transportar as amostras em caixa isotérmica com placas acumuladoras térmicas congeladas e realizar a análise até 6 horas após a colheita

Figura 1. Procedimento para a recolha de amostras de água a partir de uma torneira.

1. Segurar o frasco numa zona perto da sua base e mergulhá-lo na massa de água com a boca virada para baixo. Deve mergulhar-se até cerca de metade da altura da coluna líquida ou pelo menos até cerca de 20 cm abaixo da superfície da água 2. Virar o frasco até que o gargalo aponte ligeiramente para a superfície e a boca esteja voltada contra a corrente. Se não existir qualquer corrente (por exemplo, no caso de um reservatório) empurrar o frasco horizontalmente 3. Recolher a amostra e fechar imediatamente o frasco

3.1.2 ENUMERAÇÃO DE MICRORGANISMOS VIÁVEIS A 22ºC E A 37ºC (ISO 6222, 1999)

Consiste na enumeração de microrganismos cultiváveis2, por contagem de UFC em agar nutritivo após incubação aeróbia a 2 e a 37ºC, em águas destinadas ao consumo humano. Faz-se a inoculação de um volume conhecido de amostra ou suas diluições, por homogeneização com um meio de cultura específico em caixas de Petri, com incubação de um conjunto a 37ºC durante 4 horas e de outro conjunto a 22ºC durante 68 horas. No final contam-se as colónias das caixas contáveis e faz-se o cálculo do número de UFC por mililitro da amostra.

As bactérias aeróbias mesófilas são aquelas que se multiplicam em aerobiose a temperaturas entre 20 e 40ºC. Neste grupo existem bactérias patogénicas e não patogénicas. O método permite-nos conhecer a qualidade microbiológica da água; elevadas quantidades de mesofilos indicam que a água não é apropriada para consumo humano.

Material e métodos

1. Recolher, manipular e preservar as amostras de acordo com as normas EN 25667-2 e EN ISO 5667-3 (ver acima)

2 Todos os microrganismos – bactérias, fungos e leveduras – capazes de formar colónias no meio especificado sob as condições de teste descritas.

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2. Fazer 3 diluições decimais sucessivas da amostra, fazendo inoculações da amostra e das suas diluições3 3. Incorporar um inóculo de 1 mL em 15-20 mL de meio plate count agar (PCA) fundido 4. Inocular no mínimo uma caixa de Petri por cada temperatura de incubação

5. Deixar solidificar, inverter e incubar um conjunto a 37 2ºC durante 4 4h e o outro conjunto a 2 2ºC durante 68 4h

6. Observar as caixas assim que terminar o tempo de incubação ou armazená-las a 5 3ºC e fazer a observação num período de 48h 7. Rejeitar as caixas de Petri que contenham colónias confluentes; nas outras caixas contar o número de colónias para cada temperatura de incubação 8. Exprimir os resultados como número de UFC/mL da amostra para cada temperatura 9. Se não existirem colónias nas caixas inoculadas com a amostra não diluída, exprimir os resultados como não detectados num mL. Se existirem mais de 300 colónias nas caixas inoculadas com a diluição maia alta utilizada, exprimir os resultados como> 300

Resultados

10. O relatório deve incluir a referência à norma e a classificação da qualidade da água em função da sua utilização e de acordo com a legislação e deve incluir também: a identificação completa da amostra, a técnica de inoculação e o meio de cultura utilizado, o tempo e a temperatura de incubação, os resultados de contagem expressos como UFC/mL e qualquer ocorrência particular observada durante o decorrer da análise

3.1.3 ENUMERAÇÃO DE COLIFORMES TOTAIS, FECAIS E DETECÇÃO DE E. COLI

O grupo dos coliformes pertence à família Enterobacteriaceae e inclui vários géneros: Escherichia, Citrobacter, Enterobacter e Klebsiella. O seu habitat natural é o intestino do homem e dos outros animais homeotérmicos, mas também podem ser isolados noutros ambientes como o solo, as plantas, etc., pelo que os coliformes totais não apresentam boa especificidade como indicadores de contaminação fecal. Apesar disso, a sua frequência nas fezes, a sua fácil detecção e a possibilidade de que juntamente com eles existam microrganismos patogénicos tornam-nos um dos principais indicadores de contaminação fecal.

De acordo com as normas e a legislação em vigor, a enumeração de coliformes e a detecção de E. coli em águas destinadas ao consumo humano e outras, deve fazer-se através da filtração por membrana, com cultura em meio diferencial de agar e cálculo do número de microrganismos-alvo da amostra. Na técnica da filtração por membrana, a amostra deve conter pouca matéria em suspensão de forma a não interferir com a filtração, cultura e contagem.

No entanto, a enumeração dos coliformes pode ser também feita pelo método dos tubos múltiplos com determinação do Número Mais Provável (NMP). O teste completo permite determinar os coliformes totais e os coliformes fecais (mas não especificamente E. coli) para o que são necessárias três fases: teste presuntivo, teste confirmativo e teste final.

3 O método não prevê a inoculação de diluições; o uso de diluições neste exercício pretende facultar aos alunos o treino da execução de diluições decimais sucessivas e da contagem em placa, que não seria possível caso os resultados fossem incontáveis.

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No teste presuntivo (verificação da produção de gás) inoculam-se volumes apropriados da amostra em séries de tubos contendo meio de cultura apropriado, e a incubam-se a 35 0,5º C, durante 24 2 horas. Se findo esse período não tiver havido formação de gás em nenhum tubo, prolonga-se a incubação até às 48 3 horas. O meio de cultura inibe o crescimento dos microrganismos Gram-positivos e encoraja o crescimento dos microrganismos coliformes. Os coliformes usam o oxigénio presente no meio e através da fermentação produzem ácido e gás sob condições anaeróbias. Se não existir produção de gás o resultado do teste é negativo, estabelecendo-se que não existem coliformes na amostra. A formação de gás (resultado positivo) determina a presença de coliformes na amostra. O número de tubos positivos é utilizado para calcular o NMP de microrganismos coliformes na amostra de água.

No teste confirmativo (confirmação dos resultados) todos os tubos positivos às 24 horas são repicados para um caldo de verde brilhante, lactose e sais de bílis (VBLB), incubados a 35ºC e lidos nas condições anteriormente descritas. A formação de gás confirma a presença de coliformes na amostra. Este teste confirma os resultados uma vez que a formação de gás no teste presuntivo pode ter sido devida à actividade de microrganismos não coliformes, como por exemplo Clostridium perfringens, que é Grampositiva.

No teste final (verificação da presença de coliformes fecais), repete-se o procedimento utilizado no teste confirmativo mas a incubação é feita a 4.5ºC durante 24 a 48 horas. A formação de gás determina a presença de coliformes fecais na amostra. Se não existir formação de gás a 4.5ºC mas existir a 35ºC determina-se que existem coliformes mas que não são fecais. O NMP de coliformes fecais é determinado com base no número de tubos positivos.

Um teste adicional permite determinar se a presença ou ausência de E. coli na amostra. Adiciona-se aos tubos inoculados para o teste final reagente de Kovacs (teste do indol). Uma reacção positiva (formação de um anel cor-de-rosa) mostra a presença de E. coli. Uma reacção negativa (formação de um anel da cor do meio) mostra que E. coli não faz parte da população de coliformes fecais presentes na amostra.

Material e métodos TESTE PRESUNTIVO

1. Recolher, manipular e preservar as amostras de acordo com as normas EN 25667-2 e EN ISO 5667-3 (ver acima) 2. Inocular 1 série de 5 tubos com 10 mL de meio verde brilhante duplo (contendo um tubo

Durham4) com 10 mL da amostra 3. Inocular 1 série de 5 tubos com 10 mL de meio verde brilhante simples (contendo um tubo

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