Baixe Prevalência de Hepatozoon spp. em serpentes e outras Notas de estudo em PDF para Biologia molecular, somente na Docsity! UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS CAMPUS DE BOTUCATU Prevalência de Hepatozoon spp. em serpentes e caracterização morfológica, morfométrica e molecular de Hepatozoon spp. (Apicomplexa, Hepatozoidae) de Crotalus durissus terrificus (Serpentes, Viperidae) naturalmente infectadas Tatiana Cristina Moço Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Geral e Aplicada, do Instituto de Biociências, Campus de Botucatu, UNESP, para obtenção de título de Mestre em Biologia Geral e Aplicada. Botucatu - SP 2008 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS CAMPUS DE BOTUCATU Prevalência de Hepatozoon spp. em serpentes e caracterização morfológica, morfométrica e molecular de Hepatozoon spp. (Apicomplexa, Hepatozoidae) de Crotalus durissus terrificus (Serpentes, Viperidae) naturalmente infectadas Mestranda: Tatiana Cristina Moço Orientadora: Profa. Dra. Lucia Helena O’Dwyer de Oliveira Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Geral e Aplicada, d I tit t d Bi iê io ns u o e oc nc as, Campus de Botucatu, UNESP, para obtenção de título de Mestre em Biologia Geral e Aplicada. Botucatu - SP 2008 Sumário Sumário Introdução Geral.......................................................................................................................1 Ciclo de vida de Hepatozoon spp. em serpentes.........................................................................2 Vetores e hospedeiros intermediários de Hepatozoon spp..........................................................2 Sintomatologia da infecção por Hepatozoon spp........................................................................3 Critérios taxonômicos para identificação de Hepatozoon spp....................................................3 Freqüência de Hepatozoon spp. em serpentes............................................................................4 Descrição de espécies de Hepatozoon spp. em algumas serpentes brasileiras...........................5 Caracterização molecular de Hepatozoon spp. em serpentes.....................................................7 Considerações finais...................................................................................................................9 Referências Bibliográficas........................................................................................................10 Artigo 1: Freqüência de infecção por Hepatozoon spp. (Apicomplexa, Hepatozoidae) em serpentes brasileiras recém capturadas.....................................................................................17 Resumo.....................................................................................................................................18 Abstract.....................................................................................................................................19 Introdução.................................................................................................................................20 Material e Métodos...................................................................................................................21 Resultados.................................................................................................................................21 Discussão..................................................................................................................................25 Referências Bibliográficas........................................................................................................27 Artigo 2: Caracterização morfológica, morfométrica e molecular de Hepatozoon spp. (Apicomplexa, Hepatozoidae) de Crotalus durissus terrificus (Serpentes, Viperidae) naturalmente infectadas.............................................................................................................28 Resumo......................................................................................................................................29 Abstract.....................................................................................................................................30 Introdução.................................................................................................................................31 Material e Métodos...................................................................................................................34 Resultados................................................................................................................................39 Discussão..................................................................................................................................56 Referências Bibliográficas........................................................................................................61 Conclusões gerais....................................................................................................................67 Introdução Geral 3 Sintomatologia da infecção por Hepatozoon spp. Hepatozoon spp. de répteis são, aparentemente, bem adaptados, causando pouca ou nenhuma patologia nos seus hospedeiros naturais. Em um hospedeiro não natural, as infecções podem causar doenças inflamatórias clinicamente significativas, entre elas, hepatite necrotizante, pancreatite e esplenite (Pessoa et al., 1974; Wosniak & Telford Jr, 1991). Merontes também foram encontrados no cérebro de um exemplar de Crotalus durissus terrificus que apresentou problemas neurológicos em cativeiro (Wosniak et al., 1996). Campbell (1996) também relatou que em infecções com alta parasitemia pode-se observar um quadro de anemia hemolítica. Madsen et al. (2005) relataram que o parasitismo por Hepatozoon sp. provocou uma significativa redução no crescimento de Liasis fuscus na natureza. Além disso, os autores observaram que os parasitas diminuíram o rendimento reprodutivo das fêmeas infectadas. Estes estudos demonstram que o impacto do parasitismo por Hepatozoon spp. em serpentes pode não ser observado por meio de doença aparente, mas pode ser muito importante na ecologia das espécies. O fato de seu potencial patogênico quando em hospedeiros não naturais e as proporções significativas que essa parasitose pode ganhar em condições de cativeiro, quando não há um rígido controle parasitológico, justifica a necessidade de um bom diagnóstico para evitar a disseminação da doença dentro do criadouro. Geralmente, o diagnóstico é feito pela análise do sangue periférico corado por Leishman ou Giemsa (Campbell, 1996; Moço et al., 2002; O’Dwyer et al., 2003a,b). Atualmente, diagnósticos mais modernos incluem a avaliação do sangue pela técnica de PCR (Wosniak et al., 1994). Miyamoto & Mello (2007) estudaram a relação entre a infecção por Hepatozoon spp. e a incidência da fragmentação do DNA e consequente morte de eritrócitos em C. durissus terrificus. Os resultados apontaram um aumento da fragmentação do DNA e condensação da cromatina típica de eritrócitos mortos na circulação, sugerindo que tal infecção acelere a destruição de eritrócitos em C. durissus terrificus, afetando não somente as células parasitadas, como também células normais. Critério taxonômico para identificação de Hepatozoon spp. O critério taxonômico para identificação de Hepatozoon spp. tem sido baseado principalmente na caracterização morfológica dos gamontes no sangue do hospedeiro vertebrado e dos estágios esporogônicos no hospedeiro invertebrado. Contudo, o fato da indiscutível semelhança entre os oocistos e entre os gamontes de diversas espécies de 4 Hepatozoon torna falha a identificação baseada somente nessas características (Pessoa & De Biasi, 1973 a,b; O’Dwyer et al., 2002 a,b). A grande maioria dos trabalhos descritivos sobre Hepatozoon spp. de serpentes brasileiras trazia somente informações sobre morfologia dos gamontes (formato, coloração, presença de cápsula) e dados morfométricos, que geralmente limitavam-se à descrição do comprimento e largura dos gamontes e cistos. Porém, outras variáveis como medidas de área do parasita e do seu núcleo têm sido utilizadas, assim como, metodologias empregando técnicas moleculares (Telford Jr et al., 2004, Rubini et al., 2005b) e sistemas computacionais de análise de imagens para a biometria dos parasitas (Silva et al., 1999 a,b; Moço et al., 2002). Contudo, para todos esses aspectos, encontramos na literatura dados conflitantes, devido, geralmente, à discrepância entre as técnicas antigas e recentes utilizadas em tais pesquisas. Outro fator a ser considerado é a baixa especificidade aos hospedeiros vertebrados e invertebrados, assim, uma mesma espécie de Hepatozoon pode parasitar mais de uma espécie de serpente, e uma única serpente pode ser parasitada por mais de uma espécie de Hepatozoon (Smith, 1996). Prevalência de Hepatozoon spp. em serpentes Até pouco tempo, eram raros os estudos sobre prevalência e caracterização de espécies de Hepatozoon em serpentes brasileiras. Em um destes estudos, foi relatada prevalência de 62% para Boa constrictor, 24% para Bothrops jararaca e 11% para C. durissus terrificus (Pessoa et al., 1974). Contudo, não há informação se esses animais foram recém capturados da natureza ou se já estavam em cativeiro por algum período de tempo. É válido notar que as prevalências em animais em condições de cativeiro podem não corresponder às prevalências em condições naturais. O’Dwyer et al. (2003a), pesquisando somente animais recém capturados, relataram prevalência de 16,4% de infecção para Hepatozoon spp., com positividade de 38,9% para Boa constrictor amarali, 35,3% para Bothrops jararaca e 19,4% para C. durissus terrificus . Moço et al. (2007), em um estudo realizado com 906 serpentes recém capturadas e doadas ao CEVAP – Centro de Estudos e Venenos de Animais Peçonhentos – UNESP, Botucatu, São Paulo; pertencentes a 33 espécies procedentes de 46 municípios do Estado de São Paulo, um município do Estado do Mato Grosso e outro do Estado do Paraná, relataram a infecção por Hepatozoon spp. em 125 (13,8%) serpentes. As prevalências da infecção em serpentes peçonhentas e não peçonhentas foram 15,1% e 8,7%, respectivamente. As espécies 5 com taxa de infecção mais significativas foram 21,8% em B. jararaca, 19,1% em B. constrictor amarali e 15,8% em C. durissus. Os municípios onde ocorreram maiores taxas de infecção foram Conchas, Itatinga e Pardinho com, respectivamente, 47,6%, 26,7% e 17,1% de positividade para Hepatozoon spp. Descrição de Hepatozoon spp. parasitas de serpentes brasileiras A descrição da maior parte das espécies de Hepatozoon de serpentes foi baseada apenas em características morfológicas de gamontes e formas esporogônicas, o que sugere dados subestimados para esses parasitas (Tabela 1). Por outro lado, várias descrições tiveram como base somente a espécie do hospedeiro e uma mesma espécie de Hepatozoon pode ter recebido vários nomes, de acordo com a espécie de serpente. Além das espécies já descritas para C. durissus terrificus, Hepatozoon romani e Hepatozoon capsulata (Phisalix, 1931a), foram diagnosticados, na mesma espécie de serpente, gamontes que diferiam destes e que poderão, futuramente, ser caracterizados como novas espécies (Moço et al., 2002; O’Dwyer et al., 2003b). Moço et al. (2002) observaram um exemplar de C. durissus terrificus infectado com Hepatozoon sp. cujos gamontes apresentavam corpo afilado e alongado, citoplasma claro, sem granulações e núcleo denso e homogêneo localizado centralmente ou ligeiramente deslocado para uma das extremidades. As dimensões desses gamontes foram 33,2 ± 4,1µm2 de área, 14,7 ± 0,6 µm de comprimento e 2,4 ± 0,4 µm de largura. O’Dwyer et al. (2003b) descreveram uma pequena espécie de Hepatozoon, encontrada em outro exemplar de C. durissus terrificus, cujos gamontes eram menores dos que os usuais e apresentavam citoplasma claro, sem granulações e núcleo grande ocupando boa parte do citoplasma. Suas dimensões foram 24,6 ± 3,0 µm2 de área, 8,1 ± 0,5 µm de comprimento e 3,8 ± 0,4 µm de largura. A parasitemia observada foi extremamente elevada (56,6%), o que também é incomum, e os parasitas alteravam acentuadamente as hemácias infectadas. Além destas formas observadas, têm sido examinadas no Departamento de Parasitologia, IBB, exemplares de C. durissus terrificus infectadas com vários outros tipos de gamontes de Hepatozoon spp., demonstrando que o número de espécies desse gênero infectando essa espécie de serpente pode ser muito maior do que o já descrito na literatura (O’Dwyer et al., 2002 a,b, 2004). 8 uma seqüência parcial do gene 18S rRNA de Hepatozoon spp., baseados nos dados de alinhamento para H. canis (AF176835), H. americanum (AF176836) e H. catesbianae de anfíbios (AF176837). Os autores relataram que as duas amostras estudadas possuíam seqüências idênticas e foram intimamente relacionadas com H. canis de Israel, com 99% (617/625) de identidade. Tanto H. americanum quanto H. catesbianae estavam relacionados distantemente com a amostra japonesa, com 94% (586/625) e 91% (566/625) de identidade, respectivamente. Os autores concluíram que a amostra de Hepatozoon encontrada no Japão deve ser uma variação da cepa de H. canis. A seqüência do gene 18S rRNA do Hepatozoon sp. do Japão foi depositada no Genbank sob o número AF418558. Ujvari et al. (2004) utilizaram técnicas moleculares para diagnosticar a infecção por Hepatozoon sp. em L. fuscus encontrando altas taxas. Contudo, os autores não nomearam a espécie de Hepatozoon encontrada, pois observaram a mesma seqüência de nucleotídeos em outras quatro espécies de répteis e por não possuírem outros dados biológicos do protozoário. Os autores sugeriram que uma mesma espécie de Hepatozoon tem capacidade de infectar hospedeiros de diferentes famílias. Estes estudos demonstram a necessidade de se realizar estudos detalhados, biológicos e moleculares, para uma correta identificação das espécies de Hepatozoon que ocorrem em serpentes. Telford Jr et al. (2004) compararam isolados de DNA de hemogragarinas, morfologicamente semelhantes, de quatro espécies de serpentes do nordeste da Flórida, isolados de Hepatozoon sauritus, parasita de Thamnophis sauritus sackenii, da região sudeste da Flórida e isolados de Hepatozoon sirtalis, estes morfologicamente distintos, também do Nordeste da Flórida. O alinhamento da seqüencia de nucleotídeos de 530 pb do gene 18S rRNA revelou dois halotipos de hemogregarinas. Estes dados indicam a existência de dois grupos, um deles, incluindo H. sauritus e as quatro amostras do nordeste da Flórida e outro, composto das amostras de H. sirtalis. Entretanto, H. sauritus é tido como uma espécie politópica em contraste com outras oito espécies de Hepatozoon descritas em serpentes da Flórida, as quais parecem parasitar apenas uma espécie hospedeira. No Brasil, Rubini et al. (2005a) caracterizaram geneticamente a espécie de Hepatozoon que acomete cães utilizando os oligonucleotídeos HepF e HepR desenhados por Inokuma et al. (2002) e os mesmos oligonucleotídeos foram utilizados para caracterizar a espécie de Hepatozoon encontrada em gatos (Rubini et al., 2006). Recentemente, Rubini et al. (2005b) realizaram a primeira caracterização molecular de Hepatozoon sp. de serpentes, no caso, Hydrodynastes gigas, na América Latina. O DNA do 9 sangue da serpente foi extraído com kit “Nucleo Spin Blood mini kit”, segundo a recomendação do fabricante. Os oligonucleotídeos utilizados foram HepF e HepR. O produto amplificado foi visualizado em gel de agarose e foi, posteriormente, seqüenciado em ambas as direções, utilizando o “ABI Prism® BigDyeM Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit” (PE Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). A PCR foi eficiente em detectar Hepatozoon sp. do sangue de H. gigas com amplificação de produto de 625 bp. O seqüenciamento indicou que é possível que se trate de uma única espécie de Hepatozoon com 98,9% de identidade com o isolado 1 (AY252110) de Stegonotus cuculattus (Colubridae) da Austrália e 96,0% de identidade com H. catesbianae (AF176837) de anfíbios. Criado-Fornelio et al. (2007) desenvolveram um ensaio de PCR quantitativo (qPCR) para o diagnóstico de Hepatozoon spp. em mamíferos carnívoros com reagente “SYBR Green I®”. O método consiste na amplificação de um fragmento de 235 pb do gene 18S rRNA, com capacidade de detectar menos de 0,1 fg de DNA parasitário. O qPCR foi testado em cães e gatos e, comparando-o ao PCR padrão, mostrou-se 15,8% mais sensível na detecção de H. canis (espécie identificada através de sequenciamento). Futuramente, esse ensaio poderá ser testado para Hepatozoon spp. de serpentes. Considerações finais Estudos morfométricos, associados a estudos das diferentes fases do ciclo de vida do parasita, tanto no vetor invertebrado como no hospedeiro intermediário, e às recentes técnicas moleculares, podem contribuir sobremaneira para uma caracterização mais apurada das diferentes espécies do gênero Hepatozoon de serpentes, e procurar suprir a falta considerável de informações nessa área. A variedade de tipos de gamontes de Hepatozoon spp. que pode parasitar uma mesma espécie de serpente, a falta de descrição destas espécies e a importância de tal infecção na ecologia e na manutenção de serpentes em cativeiro (Wosniak & Telford Jr, 1991; Mader, 1996; Madsen, 2005), justificam o estudo e caracterização destes protozoários Assim, trabalhos acerca dessa temática são de fundamental importância para o conhecimento desde subestimado grupo de parasitas. 10 Referências Bibliográficas1 ARANTES, J.B. Estudos parasitológicos. II. 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Parasitol., v. 91, p. 139-143. 2005a. 17 Prevalência de infecção por Hepatozoon spp. (Apicomplexa, Hepatozoidae) em serpentes brasileiras recém capturadas Tatiana Cristina Moço1,3, Reinaldo José da Silva2, Thomaz Henrique Barrella 1,3, André Mesquita Trombeta1, Michelle Vanessa Campagner3, Bruno Garzzesi3, Braz Titton Júnior3, Denise Dutra Menezes Leal1, Lucia Helena O’Dwyer de Oliveira2. 1Mestrandos do Programa de Pós Graduação em Biologia Geral e Aplicada, Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista, Distrito de Rubião Jr.,18.618-000, Botucatu, São Paulo, Brasil. Email: tati13moco@hotmail.com 2Departamento de Parasitologia, Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista, Distrito de Rubião Jr.,18.618-000, Botucatu, São Paulo, Brasil. 3Centro de Estudos e Venenos de Animais Peçonhentos – CEVAP, Universidade Estadual Paulista, Campus da Fazenda Lageado, Botucatu, São Paulo, Brasil. 18 Resumo Hepatozoon spp. são os mais comuns protozoários intracelulares encontrados em serpentes. Tendo em vista a falta considerável de estudos sobre esses parasitas e a importância dessa infecção na ecologia e na manutenção de serpentes em cativeiro, o objetivo do presente estudo foi determinar a prevalência da infecção por Hepatozoon spp. em serpentes da região de Botucatu, São Paulo. Foram investigadas 906 serpentes recém capturadas e doadas ao CEVAP – UNESP, Botucatu, São Paulo. Destas, 722 (79,7%) eram peçonhentas e 184 (20,3%) não peçonhentas. As espécies peçonhentas mais representativas foram Crotalus durissus (n=556), Bothrops jararaca (n=87) e Bothrops pauloensis (= Bothrops neuwiedii pauloensis) (n=47) e as não peçonhentas foram Oxyrhopus guibei (n=49), Boa constrictor amarali (n=42) e Waglerophis merremi (n=16). Esfregaços sanguíneos foram confeccionados com sangue obtido da veia caudal. A infecção por Hepatozoon spp. foi detectada em 125 (13,8%) serpentes. As prevalências da infecção em serpentes peçonhentas e não peçonhentas foram 15,1% e 8,7%, respectivamente. As espécies com taxas de infecção mais significativas foram 21,8% em B. jararaca, 19,1% em B. constrictor amarali e 15,8% em C. durissus. Os municípios onde ocorreram maiores taxas de infecção foram Conchas, Itatinga e Pardinho com, respectivamente, 47,6%, 26,7% e 17,1% de positividade para Hepatozoon spp. Palavras- chave: Hepatozoon, serpentes, prevalência. 19 Abstract Hepatozoon spp. are the most common intracellular protozoa found in snakes. As studies on these parasites are very scarce and the importance of this infection in the ecology and maintenance of snakes in captivity, the aim of this study was to determine the prevalence of Hepatozoon spp. infection in snakes from the Botucatu region of São Paulo State, Brazil. We investigated 906 recently captured snakes donated to CEVAP – UNESP, Botucatu, São Paulo. Of these, 722 (79.7%) were venomous and 184 (20.3%) non-venomous. The more common venomous species were Crotalus durissus (n=556), Bothrops jararaca (n=87), and Bothrops pauloensis (= Bothrops neuwiedii pauloensis) (n=47), and non-venomous were Oxyrhopus guibei (n=49), Boa constrictor amarali (n=42), and Waglerophis merremi (n=16). Blood smears were made using caudal vein blood samples. Hepatozoon spp. infection was detected in 125 (13.8%) snakes. Infection prevalencies were 15.1% and 8.7% in venomous and non-venomous snakes, respectively. The highest infection rates were 21.8% in B. jararaca, 19.1% in B. constrictor amarali, and 15.8% in C. durissus. The places where the highest infection rates for Hepatozoon spp. were 47.6%, 26.7%, and 17.1% in Conchas, Itatinga, and Pardinho, respectively. Keywords: Hepatozoon, snakes, frequency. 22 As espécies de serpentes examinadas e seus respectivos diagnósticos foram listados abaixo (Tabela 1). Tabela 1. Diagnóstico da infecção por Hepatozoon spp. por esfregaço de sangue periférico em serpentes recém capturadas no Estado de São Paulo/Mato grosso e Paraná. Família/Espécie Infectadas Não Infectadas Total Colubrídeos Chironius flavolineatus 0 3 3 Chironius quadricarinatus 0 1 1 Chironius sp. 0 2 2 Clelia sp. 0 1 1 Dipsas indica 0 1 1 Helicops sp. 0 1 1 Hydrodynastes gigas 1 0 1 Leptodeira annulata 0 2 2 Liophis almadensis 0 4 4 Liophis sp. 0 2 2 Mastigodryas bifossatus 0 3 3 Oxyrhopus guibei 1 48 49 Oxyrhopus rhombifer 0 1 1 Phalotris lativittatus 0 1 1 Phalotris mertensi 0 10 10 Philodryas olfersii 0 3 3 Philodryas patagoniensis 0 9 9 Pseudoboa neuwiedii 0 1 1 Rachidelus brazili 0 1 1 Sibynomorphus mikani 0 12 12 Simophis rhinostoma 1 7 8 Spilotes pullatus 1 4 5 Thamnodynastes sp. 1 1 2 Waglerophis merremi 2 14 16 Xenopholis undulatus 0 1 1 Boídeos Boa constrictor amarali 8 34 42 Eunectes murinus 1 1 2 Viperídeos Bothrops alternatus 1 17 18 Bothrops jararaca 19 67 87 Bothrops moojeni 1 12 13 Bothrops pauloensis 0 47 47 Crotalus durissus 88 468 556 Elapídeos Micrurus sp. 0 1 1 Total 125 781 906 A infecção por Hepatozoon spp. foi detectada em 125 (13,8%) serpentes. As prevalências da infecção em serpentes machos e fêmeas foram, respectivamente, 14,4% e 13,0% (ρ > 0,05). Entre serpentes peçonhentas e não peçonhentas as prevalências de infecção foram 15,1% e 8,7%, respectivamente (ρ > 0,05). As prevalências mais significativas foram 21,8% em B. jararaca, 19,1% em B. c. amarali e 15,8% em C. durissus (ρ > 0,05). 23 As taxas de infecção em Viperidae, Boidae e Colubridae foram, respectivamente, 15,1%, 20,9% e 4,9% (ρ < 0,05). A procedência das serpentes foi listada abaixo (Tabela 2) e os municípios em que as serpentes apresentaram maior prevalência de infecção foram Conchas, Itatinga e Pardinho com, respectivamente, 47,6%, 26,7% e 17,1% de positividade para Hepatozoon spp. (ρ < 0,05). A análise da taxa de infecção, nas espécies C. durissus terrificus e de B. jararaca, indicou que a prevalência entre machos e fêmeas foi similar (ρ > 0,05). Apesar da prevalência ter, aparentemente, sido maior em fêmeas de B. constrictor amarali, não houve diferença estatística entre os sexos (ρ > 0,05) (Figura 1). 0 5 10 15 20 25 30 Crotalus durissus Bothrops jararaca Boa constrictor amarali Porcentagem Es pé ci es Fêmeas Machos Figura 1. Prevalência da infecção por Hepatozoon spp. entre machos e fêmeas de espécies de serpentes naturalmente infectadas no Estado de São Paulo (ρ > 0,05). 24 Tabela 2. Procedência, número de serpentes coletadas e diagnóstico da infecção por Hepatozoon spp. em municípios do Estado de São Paulo, Mato Grosso e Paraná.. Município/Estado Infectadas Não Infectadas Número de serpentes coletadas Águas de Santa Bárbara/SP 0 3 3 Angatuba/SP 0 1 1 Anhembi/SP 4 20 24 Anhumas/SP 1 0 1 Araraquara/SP 0 10 10 Avaré/SP 1 24 25 Bofete/SP 6 49 55 Boituva/SP 0 1 1 Botucatu/SP 29 309 338 Canarana/MT 0 1 1 Cerqueira César/SP 2 41 43 César Neto/SP 1 0 1 Charqueada/SP 0 2 2 Conchas/SP 10 11 21 Dois Córregos/SP 0 3 3 Emilianópolis/SP 1 5 6 Fartura/SP 0 10 10 Iaras/SP 1 5 6 Ibitinga/SP 2 7 9 Itaí/SP 0 1 1 Itapeva/SP 0 4 4 Itaporanga/SP 1 8 9 Itararé/SP 2 3 5 Itatinga/SP 31 85 116 Jaú/SP 0 1 1 Juquiatiba/SP 0 1 1 Laranjal Paulista/SP 5 30 35 Lençóis Paulista/SP 1 13 14 Lins/SP 1 4 5 Macatuba/SP 0 1 1 Pardinho/SP 12 58 70 Pereiras/SP 1 0 1 Piapara/SP 0 2 2 Piracicaba/SP 2 0 2 Piraju/SP 0 2 2 Pirambóia/SP 1 2 3 Porangaba/SP 1 0 1 Pratânia/SP 0 1 1 Ribeirão Claro/SP 0 1 1 Santa Maria da Serra/SP 5 31 36 São José dos Campos/SP 1 1 2 São Manuel/SP 0 17 17 São Pedro/SP 1 2 3 Sorocaba/SP 0 2 2 Taguaí/SP 0 2 2 Taquarituba/SP 1 2 3 Tejupá/SP 1 4 5 ?/PR 0 1 1 Total 125 781 906 SP = Estado de São Paulo, MT = Estado do Mato Grosso, PR = Estado do Paraná ? = Município não identificado pelo coletor 27 Referências Bibliográficas1 DE BIASI, P.; PESSOA, S.B.; BELLUOMINI, H.E. Nota sôbre a transmissão congênita de hemogregarinas em duas espécies de serpentes peçonhentas vivíparas. Atas Soc. Biol. RJ., v. 15, p. 27-28, 1971. DE BIASI, P.; PESSOA, S.B.; BELLUOMINI, H.E. Novas observações sobre transmissão congênita de hematozoários de serpentes peçonhentas vivíparas. Mem. Inst. Butantan, v. 36, p. 245-249, 1972. HULL, R.W.; CAMIN, J.H. Haemogregarine in snakes: the incidence and identity of the erythrocytic stages. J. Parasitol., v. 46, p. 515-523, 1960. MADER, D.R. Reptile medicine and surgery. Philadelphia: Saunders, 1996. 512p. O’DWYER, L.H.; MOÇO, T.C.; BARRELLA, T.H.; VILELA; F.C.; SILVA, R.J. Prevalence of Hepatozoon spp. (Apicomplexa, Hepatozoidae) among recently captured Brazilian snakes. Arq. Bras. Med. Vet. Zootec., v. 55, n. 3, p. 309-314, 2003. MOÇO, T.C.; O’DWYER, L.H.; VILELA, F.C.; BARRELLA, T.H.; SILVA, R.J. Morphologic and morphometric analysis of Hepatozoon spp. (Apicomplexa, Hepatozoidae) of snakes. Mem. Inst. Oswaldo Cruz, v. 97, n. 8, p. 1169-1176, 2002. PESSOA, S.B.; De BIASI, P.; PUORTO, G. Nota sobre a prevalência de hemoparasitas em serpentes do Brasil. Mem. Inst. Butantan., v. 38, p.69-118, 1974. SANTOS, M.M.V., O'DWYER, L.H., SILVA, R.J. Seasonal variation of Hepatozoon spp. (Apicomplexa, Hepatozoidae) parasitemia from Boa constrictor amarali (Serpentes, Boidae) and Hydrodynastes gigas (Serpentes, Colubridae). Parasitol. Res., v. 97, p. 94-97, 2005. SILVA, R.J. As serpentes. Jaboticabal: Fundep, 2000. 141p. TELFORD JR., S.R. Reptilian hemoparasites. In: HOFF G.L.; FRYE, F.L; JACOBSON, E.R. (Eds.). Diseases of amphibians and reptiles. New York: Plenum Publishing Corporation, 1984. p. 385-517. WOZNIAK, E.J.; TELFORD JR., S.R. The fate of Hepatozoon species naturally infecting Florida Back Racers and watersnakes in potencial mosquito and soft tick vectors, and histologic evidence of pathogenicity in unnatural hostspecies. Int. J. Parasitol., v. 21, p. 511- 516, 1991. 1Referências bibliográficas apresentadas segundo as normas da Associação Brasileira de Normas Técnicas. NBR 6023: Informação e documentação-Referências-Elaboração. Rio de Janeiro, 2002. 22p.BIOSIS. Serious sources of the BIOSIS preview database. Philadelphia, 1996. 468p. Artigo 2: Caracterização morfológica, morfométrica e molecular de Hepatozoon spp. (Apicomplexa, Hepatozoidae) de Crotalus durissus terrificus (Serpentes, Viperidae) naturalmente infectadas 28 Caracterização morfológica, morfométrica e molecular de Hepatozoon spp. (Apicomplexa, Hepatozoidae) de Crotalus durissus terrificus (Serpentes, Viperidae) naturalmente infectadas Tatiana Cristina Moço1, Reinaldo José da Silva2, Newton Goulart Madeira2, Karina dos Santos Paduan3, Adriano Stefani Rubini4, Betina Metzger5, Lucia Helena O’Dwyer de Oliveira2. 1Mestranda do Programa de Pós Graduação em Biologia Geral e Aplicada, Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista, Distrito de Rubião Jr.,18.618-000, Botucatu, São Paulo, Brasil. Email: tati13moco@hotmail.com 2Departamento de Parasitologia, Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista, Distrito de Rubião Jr.,18.618-000, Botucatu, São Paulo, Brasil. 3Doutoranda do Programa de Pós Graduação em Genética, Instituto de Biociência, Universidade Estadual Paulista, Distrito de Rubião Jr., 18.618-000, Botucatu, São Paulo, Brasil. 4Doutorando do Programa de Pós Graduação em Biologia Geral e Aplicada, Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista, Distrito de Rubião Jr.,18.618-000, Botucatu, São Paulo, Brasil. 5Mestranda do Programa de Pós Graduação em Medicina Veterinária, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia – FMVZ, Universidade Estadual Paulista, Distrito de Rubião Jr.,18.618-000, Botucatu, São Paulo, Brasil. 31 Introdução O gênero Hepatozoon compreende protozoários pertencentes ao filo Apicomplexa; subordem Adeleina e família Hepatozoidae (Levine et al., 1980). Hepatozoon spp. têm sido observados frequentemente parasitando serpentes (Smith, 1996). Seu ciclo é heteroxênico, envolvendo um estágio merogônico (fase assexuada) no hospedeiro vertebrado e outro, gametogônico (fase sexuada) e esporogônico, no vetor invertebrado (Wozniak et al., 1994). O critério taxonômico empregado para a identificação de Hepatozoon tem sido baseado principalmente na caracterização morfológica dos gamontes no sangue periférico do hospedeiro vertebrado e também dos cistos encontrados nos órgãos internos dos hospedeiros vertebrados e invertebrados. Até 1996, 121 espécies de Hepatozoon de serpentes eram reconhecidas (Smith, 1996). Entretanto, muitas dessas espécies foram descritas utilizando somente a morfologia dos gamontes e a presença em determinada espécie de serpente. Após 1996, pelo menos mais 12 novas espécies de Hepatozoon foram descritas infectando serpentes (Telford et al., 2001; 2002; 2005 a;b; Sloboda et al., 2007). Por outro lado, gamontes de Hepatozoon spp. com morfologia diferente dos já relatados têm sido observados, mas não nomeados, por falta de dados morfológicos e biológicos mais completos e também, por falta de caracterização molecular (Moço et al., 2002; O’Dwyer et al., 2003). Em Crotalus durissus terrificus são descritas na literatura apenas duas espécies; Hepatozoon romani e Hepatozoon capsulata (Phisalix, 1931), mas várias outras formas, distintas destas já descritas, têm sido observadas (O’Dwyer et al., 2003). Apesar de muitos artigos relatarem que as análises morfológicas e morfométricas são de pouca valia para identificação de espécies de Hepatozoon, poucos trabalhos da literatura descreveram detalhadamente a morfologia e morfometria dos parasitas. Na maioria desses trabalhos foram medidos apenas o comprimento e a largura dos gametócitos e o diâmetro dos oocistos. Moço et al. (2002) realizaram análises morfológicas e morfométricas detalhadas de cinco espécies de Hepatozoon de serpentes e conseguiram observar três grupos distintos baseados unicamente nestas características. Métodos diagnósticos mais modernos incluem a avaliação do sangue pela técnica de reação de polimerização em cadeia - PCR (Wozniak et al., 1994). Vários estudos sobre a evolução esporogônica em Hepatozoon spp. vêm sendo conduzidos ao longo dos anos. Ball et al. (1967) estudaram a evolução esporogônica do Hepatozoon rarefasciens, de Drymarchon corais, em mosquitos Culex tarsalis, Anopheles 32 albimanus e Aedes sierrensis. Bashtar et al. (1991) conduziram estudos sobre esporogonia de Hepatozoon mehlhorni, de Echis carinatus, em Culex pipiens. Lowichik et al. (1993) estudaram a esporogonia de Hepatozoon mocassini, de Crotalus horridus atricaudatus, em Aedes aegypti. Sloboda et al. (2007) descreveram Hepatozoon ayorgbor, parasita de Python regius, e obtiveram sucesso na infecção experimental de mosquitos Culex quinquefasciatus. Os autores também conseguiram completar o ciclo de vida desse parasita, infectando um exemplar juvenil de P. regius através da ingestão dos mosquitos infectados. No Brasil, a esporogonia de Hepatozoon spp. de serpentes vem sendo pesquisada desde meados da década de setenta, desde então, várias espécies de serpentes foram utilizadas para tal propósito. As infecções experimentais de parasitas de serpentes terrestres foram feitas, geralmente, em mosquitos Culex fatigans e Culex dolosus, e as de serpentes semi- aquáticas, nas sanguessugas Haementeria lutzi e Haementeria gracilis (Pessoa & Cavalheiro, 1969a,b; Pessoa et al., 1970a,b,c, 1971a,b, 1972, 1974a,b,c; Pessoa & De Biasi, 1973a,b, 1974). O’Dwyer et al. (2002a,b) conduziram estudos sobre estágios esporogônicos de Hepatozoon sp. de C. durissus terrificus, em Culex quinquefasciatus e no carrapato Amblyomma rotundatum, assim como de Hepatozoon terzii, de Boa constrictor amarali, em A. aegypti e C. quinquefasciatus. Paperna & Lainson (2003) estudaram a ultraestrutura de cistos esporogônicos de Hepatozoon caimani, de Caiman crocodilus, e de H. terzii, de B. constrictor, em mosquitos C. quinquefasciatus. Contudo, o fato da indiscutível semelhança entre os oocistos e entre os gamontes de diversas espécies de Hepatozoon torna falha a identificação baseada somente nessas características (Pessoa & De Biasi, 1973a,b; Moço et al., 2002). Por outro lado, existe a possibilidade de uma mesma espécie apresentar características morfológicas diferentes em hospedeiros diversos (Ball, 1970). Vários estudos foram realizados com o intuito de caracterizar geneticamente espécies de Hepatozoon de anfíbios e répteis. O primeiro deles foi conduzido por Wozniak et al. (1994), onde os autores conseguiram amplificar o rDNA de cinco diferentes isolados de Hepatozoon spp. de serpentes. 33 Smith et al. (1999) também conduziram estudos para caracterizar espécies de Hepatozoon de serpentes, utilizando sangue total, a partir do qual foram extraídas as amostras de DNA. Foi realizada amplificação da região ITS-1 utilizando oligonucleotídeo com o sítio de ligação do final 3’ do gene 18S rDNA (5’-CGTAGGTGAACCTGCAGAAGG-3’) e um oligonucleotídeo reverso com sítio de ligação do final 5’ do gene 5.8S rDNA (5’- GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’). Perkins & Martin (1999) avaliaram que os oligonucleotídeos desenvolvidos por Wozniak et al. (1994) não são específicos para hemogregarinas e amplificam também os genes SSU rRNA dos hospedeiros vertebrados, quando o DNA é extraído do sangue. Assim, Perkins & Keller (2001) desenvolveram novos oligonucleotídeos para caracterização de Hepatozoon spp. de serpentes: HEMO 1 e outro específico para parasitas do filo Apicomplexa, HEMO 2. Mathew et al. (2000) estudaram a relação filogenética entre algumas espécies de Hepatozoon levando em consideração características moleculares, morfológicas e biológicas. De acordo com os autores, Hepatozoon americanum, Hepatozoon canis e Hepatozoon catesbianae formam um grupo monofilético, sendo que as duas espécies que infectam cães foram consideradas espécies irmãs, com similaridade de 96,4%. A primeira caracterização molecular de Hepatozoon spp. de serpentes na América Latina foi conduzida por Rubini et al. (2005b), através da técnica da PCR padronizada pelos autores (Rubini et al., 2005a, 2006). A PCR foi eficiente em detectar Hepatozoon spp. de sangue de Hydrodynastes gigas com amplificação de produto de 625 pb. Tendo em vista toda a problemática com relação à taxonomia desses parasitas, o objetivo do presente estudo foi caracterizar morfológica, morfométrica e molecularmente Hepatozoon spp. de alguns espécimes de C. durissus terrificus. 36 contaminação durante o processo foram utilizados em todas as reações um controle negativo através da substituição do ácido nucléico por H2O Milli-Q, e um controle positivo de DNA genômico obtido de uma serpente naturalmente infectada por Hepatozoon sp. O produto amplificado com volume de 8 µl foi submetido à eletroforese em gel de agarose (GIBCO BRL®) 1%. A corrida eletroforética foi realizada em cuba horizontal Hoefer HE 33 (GE Healthcare) a 100 volts por 1 hora e a banda visualizada em um transluminador UV e fotografada com câmara digital Nikon coolpix 750. Para determinação dos produtos amplificados foi utilizado o marcador de peso molecular de 100 pares de base (100bp DNA Ladder, Invitrogen®). Foram consideradas positivas as amostras que apresentaram produtos de amplificação com 500 pares de bases. Purificação dos Produtos de PCR Os fragmentos de PCR das amostras foram purificados por reação enzimática adicionando-se 2µl da enzina ExoSAP IT (GE Healthcare) a 8µl do produto de PCR de acordo com as recomendações do fabricante, sendo, a seguir, submetidos ao seqüenciamento. Clonagem Nos exemplares Cdt282 e Cdt286, cujas amostras de sangue foram incluídas no estudo e que, aparentemente, apresentavam mais de uma espécie de Hepatozoon, os fragmentos obtidos do produto de PCR foram purificados e ligados em vetores comerciais destinados para este fim (pGEM-T e/ou pTTZ57R/T). A seguir, as células de Escherichia coli DH5α foram transformadas com os vetores contendo o produto de interesse e as colônias obtidas foram analisadas através da rápida preparação de DNA plasmidial para seleção de clones recombinantes (Beuken et al., 1998) em gel de agarose. Este método permitiu identificarmos os plasmídeos recombinantes por tamanho e utilizar apenas um passo para a extração do DNA. A seguir, foi realizada a mini preparação dos plasmídeos que contém o fragmento de interesse para o seqüênciamento. Sequenciamento As seqüências de DNA foram determinadas em seqüenciador automático ABI 377 (Applied Biosystems®) utilizando-se 6 µl de 2,5x Save Money (400 mM Tris-HCl pH 9,0, 10 mM MgCl2), 2 µl BigDye™ Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit versão 3.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA), 3,2 ρmol dos oligonucleotídeos forward e reverse, e 4 37 µl do DNA genômico a 5 ng/µl. As reações de seqüenciamento foram realizadas em termociclador Whatman Biometra® (T Gradient) com os ciclos de temperatura programados para: 25 ciclos de 95°C por 10 segundos 50°C por 5 segundos, 60°C por 4 minutos, com rampa de 1°C/segundo, como recomendado pelo fabricante. Após a amplificação as amostras foram mantidas a 4°C até a precipitação. Para cada amostra foram utilizadas duas reações, sendo uma para o oligonucleotídeo foward e outra para o reverse. Precipitação das reações de Sequenciamento Para cada reação de seqüenciamento foram adicionados 80 µl de isopropanol 65%, incubando à temperatura ambiente por 20 minutos. Em seguida, as amostras foram centrifugadas à velocidade de 10.000 rpm por 25 minutos, à temperatura ambiente. O isopropanol foi removido invertendo os tubos e, a seguir, 200 µl de etanol 70% foram adicionados e centrifugados à velocidade de 10.000 rpm por 5 minutos à temperatura ambiente. Todo o etanol foi removido com auxílio de micropipeta, pois qualquer etanol residual resultaria em manchas fluorescentes. As amostras foram secas à temperatura ambiente e o DNA eluído em 2 µl de tampão de amostra contendo Formamida Hi-Di™ (Applied Biosystems) + Loading Buffer (25 mM EDTA pH 8,0 contendo 50 mg/ml Blue Dextran) (5:1). No momento da aplicação em seqüenciador automático ABI PRISM® 377 (Applied Biosystems, USA) as amostras foram aquecidas a 95°C por 5 minutos e rapidamente transferidas para o gelo. Análise dos Dados - Alinhamento das Seqüências As seqüências forward e reverse, geradas automaticamente, foram alinhadas com auxílio dos programas MERGER (http://bioweb.pasteur.fr/seqanal/alignment/intro-uk.html) e CLUSTAL W versão 1.8 (Thompson et al., 1994), comparadas com outras disponíveis no GenBank e identificadas utilizando-se o BLASTn (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). Posteriormente as seqüências foram utilizadas para construção das árvores filogenéticas utilizando-se o programa MEGA versão 2.1 (Kumar et al., 2001). Taxas de divergência foram conduzidas, utilizando-se os métodos de máxima parsimônia (MP) e distância (NJ) na reconstrução filogenética do fragmento estudado. Para se estimar o índice de consistência das análises de distância foram utilizadas árvores com teste de bootstrap sobre 1000 réplicas (Felseinstein, 1985). Os espécimes utilizados para análise filogenética e seus respectivos números de acesso do GenBank estão descritos na Tabela 1. 38 Tabela 1. Espécies de Hepatozoon utilizadas para análise filogenética e seus respectivos números de acesso do GenBank. Análise Estatística Todas as variáveis registradas para o parasita foram analisadas e comparadas utilizando-se o programa SigmaStat.3.1(Jandel Scientific Corporation). Foram empregados testes de Análise de Variância. Quando o resultado foi paramétrico utilizou-se o método Student-Newman-Keuls para comparação entre os parasitas, e quando foi não paramétrico utilizou-se o Método de Dunn’s para a comparação entre os dados. O nível de significância adotado foi de 5%. As variáveis registradas para o parasita e para as hemácias, também foram analisadas conjuntamente empregando-se um teste de análise multivariada. O teste estatístico foi realizado pelo programa MVSP 3.1. Espécies Número de acesso do GenBank Hepatozoon sp. - Varanus scalaris AY252108 Hepatozoon sp.- Boiga AY252103 Hepatozoon. Ayorgborg EF157822 Hepatozoon sp. - Stegonotus cucullatus AY252110 Hepatozoon sp. BV1 AY600626 Hepatozoon sp. BV2 AY600625 Hepatozoon felis – Spain 2 AY628681 Hepatozoon catesbianae AF130361 Hepatozoon canis – Venezuela 2 DQ439540 Hepatozoon americanum AF176836 Babesia rodhaini M87565 41 Parasita C Parasita D Normais Ax is 2 Axis 1 -0.2 -0.4 -0.6 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 -1-2-3-4-5 0 1 2 3 4 Figura 2 - Análise Multivariada dos componentes de comparação entre as hemácias normais e parasitadas pelos gamontes C e D, de Crotalus durissus terrificus 07. Gamonte E: Encontrado parasitando o exemplar Cdt01. Situava-se junto ao núcleo da hemácia. Seu formato era alongado, com citoplasma uniforme e núcleo compacto e alongado, localizado na parte central do parasita ou ligeiramente deslocado para uma das extremidades (Figura 7E). Esse gamonte alterou alguns parâmetros das hemácias parasitadas em relação às não parasitadas (Tabela 2) e, quando suas variáveis foram submetidas à análise multivariada, foram observados dois grupos distintos, o que aponta uma alteração significativa nas hemácias que albergam esse gamonte (Figura 3). Morfologicamente, assemelhava-se ao gamonte C, parasita do exemplar Cdt05. 42 Normal Parasitada Ax is 2 Axis 1 -0.2 -0.4 -0.6 -0.8 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 -0.7-1.3-2.0-2.7-3.3 0.0 0.7 1.3 2.0 2.7 3.3 Figura 3- Análise Multivariada dos componentes de comparação entre as hemácias normais e parasitadas pelo gamonte E, de Crotalus durissus terrificus 01. Gamonte F: Encontrado parasitando o exemplar Cdt09. Situava-se junto ao núcleo da hemácia, possuía tamanho pequeno, com citoplasma uniforme e núcleo compacto deslocado para uma das extremidades (Figura 7F). Apesar do seu tamanho, relativamente pequeno, este parasita alterou as hemácias em alguns parâmetros quando parasitadas por um único gamonte e em todos seus parâmetros quando parasitadas por dois gamontes (Tabela 2). Fato este também observado pela análise multivariada dos componentes de comparação entre hemácias normais e parasitadas, apesar das muitas sobreposições entre seus elementos (Figura 4). Tais alterações, entretanto, foram bem mais discretas do que as apresentadas na análise do gamonte E. Esse gamonte era, morfologicamente, semelhante ao gamonte A, parasita do exemplar Cdt05. 43 Normal 1Parasita 2 Parasitas Ax is 2 Axis 1 -0.1 -0.2 -0.3 -0.4 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 -0.81-1.62-2.44-3.25 0.00 0.81 1.62 2.44 3.25 4.06 Figura 4- Análise Multivariada dos componentes de comparação entre as hemácias normais e parasitadas pelo gamonte F, de Crotalus durissus terrificus 09. Todos os gamontes encontrados alteraram as hemácias parasitadas em pelo menos duas variáveis. Sendo que cinco das seis formas alteram quase todas as variáveis, mas em proporções distintas (Tabela 2). Ainda assim, a análise multivariada dos componentes de comparação entre hemácias parasitadas e não parasitadas, só conseguiu separar tais grupos no caso do gamonte E (parasita do exemplar Cdt01). 46 A C B E F D Figura 7- Gamontes de Hepatozoon spp. de Crotalus durissus terrificus naturalmente infectadas. Esfregaço sangüíneo corado com Giemsa (1000x). A- Cdt05; B- Cdt05; C- Cdt07; D- Cdt07; E- Cdt01; F- Cdt09. 47 O resultado da análise multivariada dos componentes de comparação entre os gamontes A, B, C. D, E e F, apontou quatro populações de parasitas bem definidas. Uma correspondente aos gamontes A, parasitas do exemplar Cdt05, outra, bem próxima desta, correspondente aos gamontes F, parasitas do exemplar Cdt09. A terceira, onde estão representados os gamontes D, parasitas do exemplar Cdt07 e uma quarta, onde se mesclam elementos correspondentes aos gamontes C (parasitas do exemplar Cdt07), E (parasitas do exemplar Cdt01) e B (parasitas do exemplar Cdt05). Tais resultados encontram-se ilustrados na Figura 8. Cdt05-A Cdt05-B Cdt07-C Cdt07-D Cdt01-E Cdt09-F Ax is 2 Axis 1 -0.05 -0.10 -0.15 -0.20 -0.25 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 -0.3-0.5-0.8-1.1 0.0 0.3 0.5 0.8 1.1 1.3 Figura 8- Análise Multivariada dos componentes de comparação entre os gamontes A, B, C, D, E e F de Crotalus durissus terrificus (Cdt) naturalmente infectadas. 48 Obtenção dos Estágios Esporogônicos Infecção experimental do exemplar Cdt05 - Em mosquitos A. aegypti Foram realizadas duas tentativas de infecção experimental para se obter estágios esporogônicos de Hepatozoon sp. deste exemplar utilizando A. aegypti. Destas, conseguimos recuperar oocistos da hemocele de apenas uma única fêmea, aos treze dias após a alimentação da colônia. (Figura 9). As dimensões desses oocistos foram 7524,4 ± 2378,4 µm2 de área, 104,7 ± 13,2 µm de comprimento e 89,3 ± 16,6 µm de largura. Figura 9. Oocistos de Hepatozoon sp. (Cdt05) recuperados da hemocele de mosquito Aedes aegypti, 13 dias após alimentação. A, B - Oocistos imaturos, exame a fresco (200x). Em mosquitos C. quinquefasciatus Foi realizada uma única tentativa de infecção experimental para se obter estágios esporogônicos de Hepatozoon sp. em C. quinquefasciatus e essa tentativa foi falha. Infecção experimental do exemplar Cdt07 Com relação ao exemplar Cdt07 foram realizadas duas tentativas de infecção experimental para obtenção de estágios esporogônicos de Hepatozoon spp. Uma delas utilizando mosquitos A. aegypti e outra C. quinquefasciatus. Ambas tentativas foram falhas. 51 Os oocistos recuperados 20 dias após a alimentação mediram 16961,8 ± 2682,9µm2 de área, 151,8 ± 13,8µm de comprimento e 143,0 ± 13,4µm de largura e seus esporocistos tinham dimensões de 701,6 ± 175,6µm2 de área, 33,5 ± 6,8µm de comprimento e 26,4 ± 2,7µm de largura. Aos 26 dias após a alimentação dos mosquitos, os oocistos recuperados mediram 12229,1 ± 4229,1µm2 de área, 128,5 ± 22,5µm de comprimento e 118,0 ± 19,7µm de largura; seus esporocistos tinham dimensões de 360,5 ± 81,7µm2 de área, 22,7 ± 3,6µm de comprimento e 20,3 ± 1,9µm de largura e os esporozoítas, 76,7 ± 6,1µm2 de área, 21,1 ± 0,3µm de comprimento e 5,1 ± 0,4µm de largura. Figura 12. Estágios esporogônicos de Hepatozoon sp. (Cdt09) recuperados da hemocele de mosquito Culex quinquefasciatus por exame a fresco. A – oocisto imaturo, 11 dias após alimentação (200x). B - Oocisto imaturo, 14 dias após alimentação (400x). C – oocisto maduro, 20 dias após alimentação (400x). D – esporozoítas livres, 26 dias após a alimentação (1000x). 52 Caracterização molecular pela técnica de PCR Como a tentativa de utilização dos oligonucleotídeos internos HepF e HepR para amplificação do DNA das amostras Cdt05, Cdt07, Cdt01 e Cdt09, não foi bem sucedida, um segundo par de oligonucleotídeos, Piro A1 foward, com 23 bases e Piro B reverse, com 21 bases, foi, então, utilizado. Resultados positivos foram alcançados com a utilização desse último par de oligonucleotídeos (Figura 13). Após a realização da técnica de PCR, as amostras de DNA obtidas das serpentes Cdt 01, 05, 07 e 09 foram utilizadas para o seqüenciamento. As amostras de DNA de Cdt05 e Cdt07 não puderam ser sequenciadas por, aparentemente, apresentarem mais de uma forma de gamonte. Essas deverão ser, futuramente, clonadas para tentativa de obter-se seu sequenciamento. Amostras anteriormente clonadas (Cdt282, Cdt286 e H. gigas) foram também seqüenciadas e incluídas no estudo. O alinhamento de tais seqüências e das seqüências das amostras de Cdt01 e Cdt09, encontram-se na Figura 14. A análise do alinhamento das cinco sequências apontou apenas mutações pontuais. Em toda a extensão do fragmento analisado, a diferença entre o parasita E (Cdt01) e o parasita F (Cdt09) é de apenas um nucleotídeo. Entre E e as amostras Cdt282 e Cdt286, existem apenas 10 pontos de mutação dos sítios polimórficos e entre as mesmas amostras e o parasita F, a 1 2 3 4 5 NO PM Figura 13. Visualização em gel de agarose 1% dos produtos de PCR do gene 18s rRNA de Hepatozoon spp. Poços de 1 a 4 - espécimes de Crotalus durissus terrifcus; Poço 5 - Controle positivo, NO - controle negativo, PM - Marcador de Peso Molecular 100 pb. 53 diferença é de 9 pontos de mutação. A diferença entre E e a amostra de H. gigas, é de 8 pontos de mutação e entre a mesma e o parasita F, 9 pontos. Comparando-se as amostras Cdt282 e Cdt286 entre si, a diferença é de apenas 1 ponto de mutação dos sítios polimórficos. Tais amostras, se comparadas à de H. gigas, diferem em 7 pontos de mutação. Hepatozoon_sp_Crot 282 CCACATCTAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATTCTAACAGTA Hepatozoon_sp_Crot 286 CCACATCTAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATTCTAACAGTA Hepatozoon_sp_Hydrody CCACATCTAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATTCTAACAACA Hepatozoon_sp_Crot Cdt1 CCACATCTAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATTCTAATAGCA Hepatozoon_sp_Crot Cdt9 CCACATCTAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATTCTAATAGCA ********************************************* * * Hepatozoon_sp_Crot 282 TAAGAGAGGTAGTGACAAGAAATAACAGTACAAGGCAGTTAAAATGCTTT Hepatozoon_sp_Crot 286 TAAGAGAGGTAGTGACAAGAAATAACAGTACAAGGCAGTTAAAATGCTTT Hepatozoon_sp_Hydrody TAAGAGAGGTAGTGACAAGAAATAACAGTACAAGGCAGTTAAAATGCTTT Hepatozoon_sp_Crot Cdt1 AAAGAGAGGTAGTGACAAGAAATAACAGTACAAGGCAGTTAAAATGCTTT Hepatozoon_sp_Crot Cdt9 AAAGAGAGGTAGTGACAAGAAATAACAGTACAAGGCAGTTAAAATGCTTT ************************************************* Hepatozoon_sp_Crot 282 GTAATTGGAATGATAGAAATTTAAACACTTTTTAAAGTATCAATTGGAGG Hepatozoon_sp_Crot 286 GTAATTGGAATGATAGAAATTTAAACACTTTTTAAAGTATCAATTGGAGG Hepatozoon_sp_Hydrody GTAATTGGAATGATAGAAATTTAAATACTTTTTAAAGTATCAATTGGAGG Hepatozoon_sp_Crot Cdt1 GTAATTGGAATGATAGAAATTTAAATACTTTTTAAAGTATCAATTGGAGG Hepatozoon_sp_Crot Cdt9 GTAATTGGAATGATAGAAATTTAAATACTTTTTAAAGTATCAATTGGAGG ************************* ************************ Hepatozoon_sp_Crot 282 GCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATAT Hepatozoon_sp_Crot 286 GCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATAT Hepatozoon_sp_Hydrody GCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATAT Hepatozoon_sp_Crot Cdt1 GCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATAT Hepatozoon_sp_Crot Cdt9 GCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATAT ************************************************** Hepatozoon_sp_Crot 282 TAAAATTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGAATTTCTGCTAAAAATAA Hepatozoon_sp_Crot 286 TAAAATTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGAATTTCTGCTAAAAATAA Hepatozoon_sp_Hydrody TAAAATTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGAATTTCTGCTAGAAATAA Hepatozoon_sp_Crot Cdt1 TAAAATTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGAATTTCTGCTAGAAATAA Hepatozoon_sp_Crot Cdt9 TAAAATTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGAATTTCTGCTAAAAATAA ******************************************* ****** Hepatozoon_sp_Crot 282 CCGGTGTGCTTTTATTAATAAAAGTGGTATCTTGGTGTGTTTTTAGCAAT Hepatozoon_sp_Crot 286 CCGGTGTGCTTTTATTAATAAAAGTGGTATCTTGGTGTGTTTTTAGCAAT Hepatozoon_sp_Hydrody CCGGTCTGCTTTTATTAATAAAAGTAGTATCTTGGTGTGTTTTTAGCAAT Hepatozoon_sp_Crot Cdt1 CCGGTTTGCTTTTATTAATAAAAGTGGTATCTTGGTGTGTTTCTAGCAAT Hepatozoon_sp_Crot Cdt9 CCGGTTTGCTTTTATTAATAAAAGTGGTATCTTGGTGTGTTTCTAGCAAT ***** ******************* **************** ******* Hepatozoon_sp_Crot 282 AATGTCCTTAGAAATGGTTTTTACTTT Hepatozoon_sp_Crot 286 AATGTCCTTAGAAATGATTTTTACTTT Hepatozoon_sp_Hydrody AATGTCCTTTGAAATGTTTTTTACTTT Hepatozoon_sp_Crot Cdt1 AATGTTCTTTGAAATGTTTTTTACTTA Hepatozoon_sp_Crot Cdt9 AATGTTCTTTGAAATGTTTTTTACTTA ***** *** ****** ********* Figura 14. Alinhamento múltiplo das seqüências realizado pelo programa CLUSTAL W (1.81). Os nucleotídeos marcados representam pontos de mutação dos sítios polimórficos. 56 Discussão As serpentes da espécie C. durissus terrificus são parasitadas por, aparentemente, uma grande variedade de gamontes de Hepatozoon spp. Algumas serpentes apresentam até cinco gamontes morfológica e morfometricamente diferentes entre si (O’Dwyer et al., 2004). Em estudo anterior (Moço et al., 2002), foi levantada a hipótese de que, através de estudos morfológicos e morfométricos mais detalhados, pudéssemos separar espécies de Hepatozoon de serpentes. Contudo, os dados obtidos até aqui não nos permitiram chegar a uma conclusão. Morfologicamente, os gamontes Cdt05A e Cdt09 são muito semelhantes entre si, porém, pela análise multivariada pudemos observar que os mesmos, apesar de agrupados próximos, aparentemente representam parasitas diferentes. Em relação à alteração induzida nas hemácias, Cdt09 alterou as hemácias em vários parâmetros, enquanto Cdt05A não. O’Dwyer et al. (2004) descreveram a ocorrência de uma pequena espécie de Hepatozoon em C. durissus terrificus cujo tamanho do parasita se assemelhou aos parasitas das duas serpentes estudadas (8,1 ± 0,5 x 3,8 ± 0,4 µm e área de 24,6 ± 3,0µm2). Porém, o núcleo do parasita descrito era mais largo e não condensado, diferente dos núcleos dos parasitas dos dois exemplares discutidos. Podemos conjecturar se uma mesma espécie de Hepatozoon poderia apresentar estas ligeiras diferenças de tamanho de acordo com o hospedeiro parasitado, e assim, os três parasitas — Cdt05A, Cdt09 e o encontrado por O’Dwyer et al. (2004) — seriam a mesma espécie, com pequenas diferenças morfológicas e morfométricas. Ball (1970) já sugeria que as formas sangüíneas de Hepatozoon poderiam variar de acordo com o hospedeiro. Os gamontes Cdt07C e Cdt01E também são morfologicamente semelhantes entre si e ambos os parasitas alteraram vários parâmetros das hemácias parasitadas. Na análise multivariada, estes gamontes apresentaram-se bem separados, entretanto, alguns indivíduos se mesclaram entre as duas populações. Outro parasita morfologicamente distinto é o Cdt5B, apesar de, morfometricamente, se colocar próximo aos Cdt01E e Cdt07C. O parasita Cdt07D tem morfologia e morfometria diferentes dos demais e posicionou- se separado na análise multivariada. Pelos resultados obtidos nesse trabalho, com relação à análise morfológica e morfométrica, podemos somente especular sobre a existência de mais de uma espécie de Hepatozoon em serpentes C. durissus terrificus. Parasitas semelhantes com morfometria diferente podem, ou não, representar espécies diferentes. 57 O estudo dos estágios esporogônicos de Hepatozoon spp. foi dificultado pelas sucessivas mortes dos mosquitos, por problemas na manutenção das colônias e pelas falhas nas infecções experimentais. Apesar de diversos autores terem tido sucesso na infecção experimental de mosquitos (Pessoa et al., 1974c; Wozniak & Telford, 1991; Smith, 1996), os resultados obtidos no presente estudo sugerem que culicídeos possam não ser os hospedeiros naturais desse protozoário. Ball et al. (1967) encontraram relação entre alta parasitemia e mortalidade dos mosquitos infectados. Wozniak & Telford (1991) também observaram alta mortalidade de mosquitos infectados e consideraram as hemogregarinas como patogênicas a estes dípteros. Observamos que os estágios esporogônicos foram mais homogêneos em relação à sua morfologia, apesar das diferenças na morfometria. Este fato nos fez levantar alguns questionamentos. O primeiro deles é se realmente os tipos diferentes de gamontes representam espécies diferentes, já que os estágios esporogônicos e esquizogônicos são muito semalhantes (Pessoa et al., 1970a,b,c, 1971a,b, 1972, 1974a,b,c; Pessoa & De Biasi, 1973a,b, 1974), ou seriam estágios evolutivos diferentes de uma mesma espécie. Por outro lado, pode ser que os estágios esporogônicos de diferentes espécies de Hepatozoon não variem ou, algumas espécies teriam mosquitos como vetores e outras, não. Desser et al. (1995) afirmaram que os oocistos maduros de uma mesma espécie variam muito de tamanho e, portanto, suas medidas teriam pouco valor taxonômico. Os oocistos observados estavam sempre livres na hemocele dos mosquitos, o que está de acordo com os achados de outros pesquisadores (Ball et al., 1967; De Biasi et al., 1972; Pessoa & De Biasi, 1973b). Contudo, esta localização pode variar. Desser et al. (1995) observaram o desenvolvimento dos oocistos no interior dos tubos de Malpighi, enquanto, Lainson et al. (2003) encontraram os oocistos na hemocele, mas, aderidos à parede do intestino. Entretanto, em ambos os estudos, foi observada uma não sincronia no desenvolvimento dos oocistos, fato também observado no presente estudo. Com relação à caracterização molecular, a tentativa de utilização dos oligonucleotídeos internos HepF e HepR para amplificação do DNA das amostras Cdt05, Cdt07, Cdt01 e Cdt09, não foi bem sucedida, apesar de já terem sido utilizados, com sucesso, na amplificação de outras amostras de DNA de três serpentes naturalmente infectadas, dois exemplares de C. durissus terrificus (Cdt 282 e Cdt 286) e um de H. gigas (Rubini et al., 2005a), que foram incluídas neste estudo. 58 Um segundo par de oligonucleotídeos foi, então, utilizado na tentativa de amplificar as amostras de DNA extraídas: Piro A1 foward e Piro B reverse. Estes oligonucleotídeos foram desenhados para amplificar DNA de Babesia spp. (Jefferies et al., 2003), mas, em estudos anteriores, verificamos que os mesmos também amplificavam DNA de Hepatozoon spp, sendo que para o primeiro parasita as bandas apresentaram 450 pb e para o segundo, aproximadamente 500 pb (Lopes, 2008). O motivo da falha na utilização dos primeiros oligonucleotídeos é, por hora, desconhecido, mas pode estar relacionado às diferenças genômicas entre as amostras. Apesar do sucesso destes dois pares de oligonucleotídeos (HepF/HepR e PiroA1/PiroB) em detectar Hepatozoon spp. de serpentes, a caracterização molecular utilizando o fragmento amplificado pelos mesmos mostrou-se ineficiente em diferenciar as espécies destes parasitas. A árvore filogenética obtida a partir da análise das seqüências do gene 18S de Hepatozoon spp. mostrou que espécies diferentes podem albergar parasitas geneticamente muito relacionados, mesmo que, morfologicamente, estes sejam distintos. Ujvari et al. (2004) sugeriram que Hepatozoon spp. de serpentes são capazes de infectar hospedeiros de diferentes níveis taxonômicos. Smith (1996) já afirmava que uma mesma espécie de Hepatozoon pode parasitar mais de uma espécie de serpente, e uma única serpente pode ser parasitada por mais de uma espécie de Hepatozoon. Pela árvore observa-se que os parasitas isolados das serpentes Cdt01 e Cdt09, apesar de serem distintas morfologicamente, são muito semelhantes entre si, pelo menos no que diz respeito ao fragmento analisado. No caso das serpentes Cdt282, que apresentou um único tipo de gamonte, e Cdt286, que apresentava cinco tipos diferentes de gamontes, a situação é ainda mais complicada, pois suas seqüências são, praticamente, idênticas, mesmo com a variedade de formas encontradas em Cdt286. Com relação a H. gigas, que também apresentava dois gamontes muitos distintos, pelas análises do fragmento amplificado, possuiria apenas uma espécie de Hepatozoon (Rubini et al., 2005b). 61 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS1 BALL, G.H. Hemogregarine life cycles. Second Int. Cong. of Parasit. J. Parasitol., v. 56, Sec. II (4) part 1, 17, 1970. BALL, H.G.; CHAO, J.; TELFORD JR, S.R. The life history of Hepatozoon rarefaciens (Sambon & Seligman, 1907) from Drymarchon corais (Colubridae), and its experimental transfer to Constrictor constrictor (Boidae). J. Parasitol., v. 53, n. 5, p. 897-909, 1967. BANETH, G.; BARTA, J.R.; SHKAP, V.; MARTIN, D.S., MACINTIRE, D.K.; VINCENT- JOHNSON, N. Genetic and antigenic evidence supports the separation of Hepatozoon canis and Hepatozoon americanum at the species level. J. Clin. Microbiol., v.38, p.1298-1301, 2000. 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Conclusões Gerais 67 Conclusões Gerais O estudo realizado com Hepatozoon spp. de serpentes, a partir da metodologia empregada, nos permitiu concluir que: 1- Hepatozoon spp. ocorre com freqüência nas serpentes da região de Botucatu, São Paulo, Brasil. 2- Não há diferença na taxa de infecção entre os sexos e entre serpentes peçonhentas e não peçonhentas. 3- Somente estudos morfométricos e morfológicos de gamontes não são suficientes na diferencição de espécies de Hepatozoon de serpentes. 4- Os estágios esporogônicos de Hepatozoon spp. apresentam grande variação morfométrica, dificultando a separação de espécies. 5- A caracterização molecular utilizando-se fragmentos do gene 18S rDNA mostrou-se ineficiente na diferenciação de espécies de Hepatozoon de serpentes.