cromatografia

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I. INTRODUÇÃO

A. Definição

A base para separação cromatográfica gasosa é a distribuição de uma amostra entre duas fases. Uma destas fases está numa cama estacionária com grande área superficial e a outra fase é um gás que percorre através da cama estacionária.

Cromatografia Gasosa é uma técnica para separação de substâncias voláteis que percorrem num fluxo gasoso através de uma fase estacionaria. Se a fase estacionária é um sólido, falamos de Cromatografia Gasosa-Sólida (G.S.C.). Isto depende das propriedades adsortivas da coluna empacotada para separar as amostras, principalmente gases. Os empacotamentos comumente usados são sílica gel, peneira molecular e carvão.

Se a fase estacionaria é um líquido, chamamos de Cromatografia Gasosa-Líquida (G.L.C.) o líquido é pulverizado como um filme fino sobre um sólido inerte e a base para separação é o particionamento da amostra dentro e fora deste filme líquido. A vasta quantidade de fases líquidas com temperaturas utilizáveis acima de 400°C fazem da GLC a forma mais versátil e seletiva de cromatografia a gás. É utilizado para análise de gases, líquidos e sólidos. Nossa maior discussão se preocupará com G.L.C.

B. História

A Cromatografia foi pela primeira vez empregada por Ramsey em 1905 para separar misturas de gases e vapores. Aqueles primeiros experimentos usavam adsorção seletiva em, ou dessorçãode, sólidos adsorventes como carvão ativado. No ano seguinte, Tsweet obteve bandas discretamente coloridas de pigmentos de plantas em uma coluna cromatográfica. Ele cunhou o termo “cromatografia”, (literalmente: escrita pela cor) que é obviamente um termo inapropriado quando aplicado as métodos correntes.

Seguindo a sugestão de Martin e Synge em um estudo que eles mais tarde foram atribuídos o Premio Nobel, James e Martin introduziram a cromatografia líquida-gasosa em 1952. A sensibilidade, velocidade, exatidãoe simplicidade deste método para separação, identificação e determinação de componentes voláteis resultaram num crescimento fenomenal. Atualmente existem mais de 18 mil referências a C.G. e a taxa de crescimento é de 1800 a 2000 por ano. É estimado que 60 mil cromatógrafos a gás estejam em uso no mundo.

FIGURA I-1 – DESENHO ESQUEMÁTICO DO SISTEMA DE UM CROMATOGRAFO A GÁS.

C. Aparelhos

As partes básicas de um cromatógrafo a gás são:

  1. Cilindro de gás de arrasto

  2. Controlador de fluxoe regulador de pressão

  3. Porta de injeção (entrada da amostra)

  4. Coluna

  5. Detector (com eletrônicos necessários)

  6. Gravador

  7. Medidores de temperatura para o injetor, coluna e detector.

Estes são discutidos em detalhes no Capítulo II.

D. Técnica

Na G.L.C. os componentes para serem separados são arrastados através da coluna por um gás inerte (gás de arrasto). A mistura da amostra é particionada entre o gás de arrasto e o solvente não volátil (fase estacionária) sustentado num sólido inerte com tamanho classificado (suporte sólido). O solvente retarda seletivamente os componentes da amostra, de acordo com seus coeficientes de distribuição, até formarem bandas separadas no gás de arrasto. Este componente das bandas deixa a coluna no fluxo gasoso e são gravados em função do tempo pelo detector.

As vantagens desta técnica de eluição são:

  1. A coluna é regenerada continuamente por uma fase gasosa inerte.

  2. Normalmente os componentes da amostra são separados completamente e misturados somente com um gás inerte tornando a coleta e as determinações quantitativas fáceis.

  3. O tempo da análise é curto.

Uma desvantagem é que componentes fortemente retidos viajam muito lentamente, ou em alguns casos não se movem totalmente. Esta dificuldade pode ser superada pela programação da temperatura usada na coluna para diminuir o tempo de eluição. A Programação da temperatura é um aumento da temperatura da coluna durante uma análise para promover uma rápida e mais versátil análise. Esta técnica é discutida em detalhes no Capitulo IX.

E. Resultados

Quando usado um gravador de gráfico impresso, o registro escrito obtido de uma análise cromatográfica é chamado de Cromatograma. Geralmente a abscissa é o tempo e a ordenada a voltagem. Um cromatograma ilustrando um possível resultado obtido é mostrado na Figura I-2.

FIGURA I-2 – CROMATOGRAMA TÍPICO; ÉSTERES DE ÁCIDOS GRAXOS

F. VANTAGENS DA GROMATOGRAFIA GASOSA

Referência específica é feita à Figura I-2 com comentários aplicáveis à técnica em geral.

  1. Velocidade

A análise inteira é completada dentro de 23 minutos. O uso do gás como a fase móvel tem a vantagem do equilíbrio rápido entre as fases: móvel e estacionária e permite alta velocidade do gás do arrasto a ser empregado. Separações requerendo só alguns segundos têm sido notificadas, entretanto, tempo de análise de minutos de duração é mais comuns em G.L.C. Separações em escala preparativa, ou resolução de amostras complexas de alta ebulição podem requerer horas.

  1. Resolução

Os picos C18, C18:1 e C18:2 representam metil ésteres de ácido esteárico, ácido oléico e ácido linoléico. A separação destes compostos por outras técnicas é extremamente difícil ou impossível. A diferença entre os pontos de ebulição é insignificante visto que os compostos variam apenas no grau de instauração. Pelo uso de solventes seletivos, entretanto, GC pode promover resoluções impossíveis por destilação ou outras técnicas.

  1. Análise qualitativa

O Tempo de Retenção é aquele da injeção ao pico máximo. Esta propriedade é característica da amostra e a fase líquida numa determinada temperatura. Com um fluxo adequado e o controle da temperatura, isto pode ser reproduzido com precisão de 1% e usado para identificar cada pico. Vários compostos podem ter tempos de retenção idênticos ou próximos, mas cada composto tem somente um tempo de retenção. Este tempo de retenção não é influenciado pela presença de outros componentes.

  1. Análise quantitativa

A área produzida por cada pico é proporcional à concentração do pico. Isto pode ser usado para determinar a concentração exata de cada componente. Na Figura I-2, as áreas do pico são 36,7%, 33,0% e 30,3% (área relativa medida por um disco integrador), enquanto que as concentrações reais eram 36,4%, 33,2% e 30,4% para o esteárico, oléico e linoléico metil ésteres. A atingível exatidão com G.C. depende da técnica, detector, método de integração e da concentração da amostra. O Capítulo VII discute estes pontos em detalhes. Para picos maiores com medição de área manual, pode-se esperar uma precisão relativa de 1 a 2%. Com técnicas adequadas, integração por integradores eletrônicos digitais ou computadores pode promover uma precisão relativa melhor que 1%.

  1. Sensibilidade

Uma boa razão para a aplicação analítica extensiva da G.C. é a disponível sensibilidade. As mais simples formas de células de condutividade térmica podem determinar abaixo de 0,01% (100 ppm). O detector de chama facilmente determina partes por milhão e a precisa captura de elétron e detectores de fósforo podem medir partes por bilhão ou picogramas (10-12g). Uma vantagem adicional desta extrema sensibilidade é a pequena quantidade de amostra requerida. Microlitros de amostra são suficientes para análises completas.

Para ganhar algum reconhecimento desta sensibilidade extrema, considerar um componente com peso molecular de 100 que é eluído no pico de duração de 10 segundos. (largura na linha de base). Se o fluxo de gás de arrasto é 30 mL/min, o componente eluído estará contido num volume de 5 mL do gás de arrasto (10 s X 30 mL/min). Deste modo 10-14 mol do componente (10-12gm/100 gm por mol) está contido em aproximadamente 2x10-4 mol do gás de arrasto (5 mL/22.400 mL por mol). A proporção de 2x10-4/10-14 significa que são 20 bilhões (2x1010) de moléculas de gás de arrasto para cada molécula do componente no pico eluído. Isto é realmente uma analise de vestígios.

  1. Simplicidade

Cromatógrafos a Gás são simples de operar e entender. A interpretação dos dados obtidos é geralmente rápida e diretamente encaminhada. O custo do cromatógrafo a gás é muito baixo comparado aos dados obtidos e o material de aprendizagem pode ser comprado por menos de US$ 600.

II. SISTEMA CROMATOGRÁFICO

A. GÁS DE ARRASTO

Um cilindro de gás a alta pressão serve como fonte de gás de arrasto. Num G.C. isotérmico a permeabilidade da coluna não varia durante uma análise. Um regulador de pressão é usado para assegurar uma pressão uniforme na entrada da coluna e assim uma taxa constante no fluxo gasoso. Numa determinada temperatura, esta taxa constante do fluxo eluirá os componentes num tempo característico (o tempo de retenção). Deste que a taxa-fluxo esteja constante, os componentes também têm um volume característico de gás de arrasto (o volume de retenção).

Comumente os gases usados são hidrogênio, hélio e nitrogênio. O gás de arrasto deve ser:

  1. Inerte para evitar interação com a amostra ou solvente.

  2. Capazes de minimizar a difusão gasosa.

  3. Facilmente disponíveis, puros.

  4. Baratos.

  5. Adequado ao detector usado.

A eficiência da coluna depende da escolha adequada da velocidade linear do gás. Um valor comum para colunas O.D. de 1/4” é 75 mL/min; para colunas O.D. de 1/8” é 25 mL/min. A taxa de fluxo ótima pode ser facilmente determinada experimentalmente fazendo uma simples gráfico Van Deemter do HEPT versus Velocidade linear do gás (veja Figura II-1). A taxa-fluxo mais eficiente é a de mínimo HETP ou máximo de pratos. Consulte o Capítulo III para detalhes adicionais.

FIGURA II-1 – GRÁFICO van DEEMTER

Um simples modo de medir a taxa do fluxo de gás é com um medidor de fluxo de bolha de sabão e um cronômetro. Veja o Apêndice para detalhes deste procedimento.

B. INTRODUÇÃO DA AMOSTRA

A amostra deve ser introduzida instantaneamente como um “plug” sobre a coluna. Uma boa checagem da técnica de amostragem é elevar a temperatura do aquecedor de injeção e diminuir a quantidade de amostra. Se qualquer um destes fatores aumenta o número de pratos teóricos, um pobre procedimento de amostragem estava sendo usado.

Gases são normalmente introduzidos por seringas (Figura II-2) ou por laçada de passagem de amostra (Figura II-3). Reprodutibilidade é melhor que 0,5% relativo a laçadas de amostra.

FIGURA II-2 – SERINGA 10 mL PARA GÁS

FIGURA II-3 – VALVULA DE AMOSTRAGEM PARA GÁS

Líquidos são manuseados com seringas justas. Recentemente dispositivos para a injeção direta de sólidos têm se tornando disponíveis no comércio. A mais fácil técnica, entretanto para sólidos é a solução num solvente cuja resposta não interfira com a amostra sendo analisada. Uma técnica comum para a introdução de gases e líquidos é introduzir uma seringa com agulha hipodérmica através de septo de auto-selagem e injetar um volume medido por uma seringa anexada. Estas seringas estão disponíveis comercialmente em vários volumes abaixo de 1 microlitro e com manejo adequado pode dar uma reprodutibilidade relativa de 2%. Seringas justas para gases também estão disponíveis. O Apêndice fornece mais detalhes sobre as técnicas com seringas.

TABELA II-1 – VOLUMES DE AMOSTRA PARA DIFERENTES COLUNAS

C. COLUNA

A tubulação da coluna pode ser feita de cobre, aço inoxidável, alumínio e vidro reto, dobrado ou enrolado sobre. O cobre pode ser inadequado quando apresenta absorção ou reação com determinados componentes da amostra (aminas, acetilenos, terpenos e esteróides).

Em geral, são usadas colunas de aço inoxidável; empacotada enquanto direta para obter um empacotamento uniforme e dobrada para facilitar longos comprimentos. Colunas diretas são mais eficientes, mas podem ser incômodas, particularmente para trabalhos em altas temperaturas. Se dobrada, o diâmetro da espiral deve ser pelo menos 10 vezes o diâmetro da coluna para minimizar a difusão e o efeito autódromo.

O comprimento das colunas empacotadas varia de algumas poucas polegadas até mais de 50 pés (aproximadamente 15 metros). Colunas analíticas comuns tem entre 3 e 10 pés de comprimento (entorno de 90 cm e 3 m). Grandes comprimentos dão mais pratos teóricos e resolução. A velocidade do gás de arrasto muda durante a passagem através da coluna e deste modo só uma pequena secção da coluna opera na taxa de fluxo ótima. Isto significa que com colunas extremamente longas, os pratos e a resolução obtidos mostram menores retornos. Além que colunas longas requerem pressões muito altas na entrada. Altas pressões apresentam problemas na técnica de injeção e para evitar fugas do gás. Uma vantagem das colunas longas, entretanto, está na capacidade da amostra ser proporcional à quantidade da fase líquida presente. Isto significa que grandes quantidades de amostra podem ser injetadas em colunas longas. Veja Tabela II-1 para quantidades típicas de amostra.

Os diâmetros da coluna variam de 0,01 até 2 polegadas I.D. e maior. Quanto menor o diâmetro da coluna, maior a eficiência da coluna. Colunas analíticas padrões são de 1/8 e 1/4 de polegada O.D.; Colunas Capilares e Micro Pak para um grande número de pratos teóricos são de 1/16 de polegada O.D. De modo evidente o aumento da capacidade de amostra da coluna é o aumento do diâmetro da coluna. Separações em escala preparativa são conduzidas em colunas com diâmetro de 3/8, 1/2 de polegada ou mais largas. Infelizmente, a má difusão e o efeito dos multicaminhos (vê Capítulo III) causam uma diminuição na eficiência da coluna com o aumento do diâmetro da coluna.

D. SUPORTE SÓLIDO

O intuito do suporte sólido é proporcionar uma grande uniformidade, com área superficial inerte para distribuição da fase líquida. Algumas das desejáveis propriedades do suporte são:

  1. Inerte (evitar absorção)

  2. Alta resistência ao esmagamento

  3. Grande área superficial

  4. Forma regular, tamanho uniforme

Estes são dois produtos básicos da Chromosorb* usados em G.C.: A Chromosorb P e a Chromosorb W. A Chromosorb P (Pink) é preparada por Johns Manville com tijolos refratários C-22, enquanto a Chromosorb W (White) é preparada por Johns Manville Celite com ajuda de filtros. A Chromosorb P é usada onde a maior eficiência da coluna é desejada. A superfície deste material, entretanto, mostra uma forte absorção de componentes polares. É um material calcinado, de cor rosa e relativamente duro. Comparado à Chromosorb P, a Chromosorb W é usada onde uma relativa superfície inerte é requerida. A eficiência da coluna obtida não é tão alta quanto à obtida com a Chromosorb P. É um fluxo de material calcinado, de cor branca e relativamente macio. É mais inerte que o P e é recomendado para compostos polares. O Capítulo IV tem mais detalhes e discussões de 2 produtos adicionais da J.M.: Chromosorb A e G.

E. FASE ESTACIONÁRIA

A escolha correta do solvente de partição a ser usado é provavelmente o mais importante parâmetro na G.L.C. Idealmente o solvente deve ter as seguintes características:

  1. As amostras devem apresentar coeficientes de distribuição diferentes.

  2. As amostras devem ter uma solubilidade razoável no solvente.

  3. O solvente deve ter uma pressão de vapor desprezível na temperatura de operação.

A versatilidade e a seletividade na G.L.C. são devido à grande variedade de solventes disponíveis. A taxa do coeficiente de partição (relativa volatilidade acima do solvente) pode mudar 50 vezes em líquidos diferentes. Isto resulta em 50 diferentes tempos de retenção e torna a separação fácil. A escolha da fase estacionária adequada é uma tarefa extremamente importante. O capítulo sobre colunas fornece informações adicionais para ajudar a escolha da fase líquida adequada.

*Chromosorb é uma marca registrada de Jonhs Manville para material de suporte para G.C.

F. TEMPERATURA

Para ser exato, tem um relatório para temperatura da câmera de injeção, para coluna e para o detector. Uma vez que a temperatura de todos os três destes componentes serve para diferentes funções, é desejável que o instrumento possua três diferentes controles de temperatura.

  1. Temperatura da porta de injeção

A porta de injeção deve ser quente suficiente para vaporizar a amostra tão rapidamente que não perca em eficiência resultante da técnica de injeção. Por outro lado, a temperatura da porta de injeção deve ser suficientemente baixa de modo que a decomposição térmica ou rearranjo sejam evitados. Um teste prático é a elevação da temperatura da porta de injeção. Se a eficiência da coluna ou a forma do pico melhorar, a temperatura da porta de injeção estava demasiadamente baixa. Se o tempo de retenção, a área ou a forma do pico mudar drasticamente, a temperatura pode estar tão alta que esteja ocorrendo à decomposição ou rearranjo.

  1. Temperatura da coluna

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