Apostila de HPLC

Apostila de HPLC

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Unidade Rio de Janeiro

1- INTRODUÇÃO

Nenhum registro das técnicas cromatográficas contemporâneas fica completo se não incluir a cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). É um tipo de cromatografia líquida que emprega pequenas colunas, recheadas de materiais especialmente preparados e uma fase móvel que é eluída sobre altas pressões. Ela tem a capacidade de realizar separações e análises quantitativas de uma grande quantidade de compostos presentes em vários tipos de amostras, em escala de tempo de poucos minutos, com alta resolução, eficiência e sensibilidade. Somente a partir dos anos 70 se conseguiu um avanço considerável da cromatografia líquida moderna que até então era essencialmente subdesenvolvida, apesar de que um dos primeiros experimentos sobre cromatografia, no inicio do século, foi o tipo que é hoje chamado cromatografia líquida clássica. O avanço foi gradual e atingiu o atual nível de sofisticação que a CLAE apresenta, devido ao revolucionário desenvolvimento tecnológico da prática deste tipo de cromatografia. Desde 1968 tornou-se possível rechear colunas com partículas de pequeno tamanho, necessárias para alta resolução e, também, adquirir equipamentos que funcionam nas altas pressões necessárias para obter uma boa velocidade de eluição. Nos últimos dez anos ocorreu o desenvolvimento de vários detectores espectrofotométricos que operam em comprimentos de onda variável até 190 nm, e houve um aumento na utilização dos detectores por fluorescência, eletroquímicos, e por fluorescência induzida por laser, bem como acoplamento com o espectrômetro de massas. Com estes, tornou-se possível a detecção da maioria dos compostos e a análise de traços em amostras complexas, como sangue, urina, solo, alimentos, petróleo, etc. Hoje em dia são comuns estudos com partículas pequenas, a execução da CLAE com fase reversa e, particularmente, o uso de equipamentos para uma perfeita eluição com gradiente, bem como de métodos especiais, tais como a formação de pares iônicos. Como resultado, dificuldades anteriores ou separações difíceis de compostos como corantes polares, isômeros, drogas básicas e seus metabólitos são agora rotina.

2- O PROCESSO CROMATOGRÁFICO

0 processo cromatográfico consiste na partição dos componentes de uma mistura entre a fase móvel e a fase estacionária. No caso da cromatografia gasosa o fluido é um gás e na cromatografia líquida o fluido é um solvente. Na cromatografia líquida a fase estacionária é constituída de partículas sólidas empacotadas em uma coluna, a qual é atravessada pela fase móvel. São as forças físicas e químicas que atuam entre os solutos e as duas fases são responsáveis pela retenção dos solutos sobre a coluna cromatográfica. A diferença na magnitude dessas forças que determina a resolução e portanto a separação dos solutos individuais. As forças elementares que agem sobre as moléculas são de cinco tipos:

1) Forças de dispersão de London ou forças de Van der Waals;

2) Interações de dipolo induzido;

3) Ligações de hidrogênio; 4) Interações dielétricas; 5) Interações eletrostáticas e coulombianas.

As variáveis que afetarem essas forças intermoleculares iram influenciar o grau de separação obtido pela passagem dos solutos através da coluna cromatográfica.

2.1 - CROMATOGRAFIA LÍQUIDA CLÁSSICA X CLAE

Na cromatografia líquida clássica (CLC) o recheio da coluna é utilizado geralmente uma só vez, porque parte da amostra usualmente se adsorve de forma irreversível. O enchimento da coluna deve ser repetido para cada separação. A aplicação da amostra, para ser feita corretamente, requer alguma habilidade, fatos que representam um desperdício de material e tempo. A vazão de eluente na CLC é promovida pela ação da gravidade e as frações individuais da amostra são coletadas manualmente ou através de um coletor de frações. As separações requerem, geralmente, várias horas e a detecção e a quantificação das frações são realizadas por análise manual. Na CLAE emprega-se um coluna fechada, reaproveitável; portanto, até centenas de separações individuais podem ser realizadas com a mesma coluna. Essas colunas são muito eficazes, mas oferecem uma grande resistência à vazão da fase móvel, ou seja, ela sofre uma perda de carga. Por esta razão é necessário empregar sistemas de bomba de alta pressão (até 400 bars) que fazem a fase móvel migrar a uma velocidade razoável através da coluna. A vazão da fase móvel é controlada facilmente, resultando em operações mais reprodutíveis, que tornam as análises executadas por CLAE mais precisas. Vários tipos de detectores, que podem ser colocados na saída da coluna, proporcionam uma identificação e quantificação continua dos componentes da amostra. A análise quantitativa pela CLAE pode atingir uma precisão superior a + 0.5%. Finalmente, separações em escala preparativa de miligramas de amostras são relativamente fáceis.

2.2 - CROMATOGRAFIA GASOSA X CLAE

Na cromatografia gasosa (CG) é necessário que a amostra seja suficientemente volátil, a fim de que possa passar através da coluna na forma de vapor, e estável termicamente para não se decompor nas condições de separação. Os métodos de detecção utilizados em CG são mais rápidos e sensíveis, a aparelhagem mais fácil de ser manipulada e em geral mais barata. A CLAE requer somente que a amostra seja solúvel na fase móvel. Assim, a CLAE é um método ideal para a separação de espécies iônicas ou macromoléculas de interesse biológico e produtos naturais lábeis, bem como uma imensa variedade de outros compostos de alta massa molecular e/ou baixa estabilidade térmica. A CLAE possui como vantagens adicionais: duas fases cromatográficas de interação seletiva com as moléculas da amostra, versus somente uma na CG e maior variedade de possíveis mecanismos de separação. As principais características de ambas as técnicas estão resumidas na Tabela 1. E a conclusão que pode ser tirada sobre elas e que se complementam na análise de diferentes tipos de amostras.

Tabela 1- Características da CG e da CLAE

Quesito CG HPLC

AmostraAmostra ou derivado volátil; termicamente estável nas condições de operação Amostra solúvel na fase móvel

Tipos de amostra

Gases, líquidos e sólidos: M de 2 até 1200Líquidos e sólidos: M de 32 até 4 x 106

Quant. mínimadetectável 10-12 g10-9 g

Capacidade preparativa

Baixa e trabalhosaBoa, com fácil coleta e possibilidade de automação

Capacidade analítica

Excelente, com separação de amostras com cerca de 200 componentes

Excelente, com separação de amostras com até 50 componentes

Pratos teóricospor coluna 20 – 300.0500 – 25.0

A Tabela 2, cita algumas vantagens e limitações da CLAE;

Tabela 2- Vantagens e limitações da CLAE

Vantagens Limitações

Menor tempo de análiseAlto custo da instrumentação Alta resoluçãoAlto custo de operação Resultados quantitativosPouco usada para análises qualitativas Boa sensibilidadeFalta de detector universal sensível VersatilidadeNecessidade de experiência no seu manuseio Automação

3- CARACTERÍSTICAS DAS FASES ESTACIONÁRIAS EM CLAE

Considerando as suas propriedades físicas, os recheios para CLAE podem ser classificados de acordo com os seguintes aspectos:

a) Sólidos rígidos, semi-rígidos ou não rígidos; b) Partículas porosas ou peliculares; c) Partículas esféricas ou irregulares; d) Partículas com diferentes diâmetros.

Sólidos rígidos a base de sílica são os recheios mais usados atualmente. Esses recheios podem resistir a pressões relativamente altas, resultando em enchimento estável e colunas eficientes de partículas pequenas.

Sólidos semi-rígidos são geralmente constituídos de partículas porosas de poliestireno entrecruzadas com divinilbenzeno. 0 semi-rígido tem sido usado para pressões até 350 bars. O maior interesse no semi-rígido atualmente é para aplicações na CLAE por exclusão com fase móvel orgânica; contudo eles também são usados na troca iônica.

Sólidos não rígidos, tais como agarose ou dextrose, usados em cromatografia por exclusão, são aplicados exclusivamente para a separação de moléculas grandes, solúveis em água, como as proteínas. Contudo, estes sólidos não rígidos não podem resistir as pressões usadas na CLAE. Os dois tipos de materiais, peliculares e porosos, diferem em algumas de suas propriedades e têm muitas outras em comum. Ambos podem ser introduzidos na coluna com certa facilidade, obtendo-se colunas muito eficazes. Elas podem ser utilizadas em cromatografia líquido-sólido, dependendo da atividade da sua superfície ou pode ser recoberto com alguma fase líquida e obter-se uma coluna para CLAE com fase quimicamente ligada. Além destes tem-se os materiais de recheio do tipo pelicular ou poroso para cromatografia por troca iônica. A Figura 1 apresenta esquematicamente algumas formas mais comuns de partículas para cromatografia de líquidos.

Os adsorventes peliculares, com diâmetro de partícula entre 30 e 45 µm, apresentam eficiência, rapidez, reprodutibilidade e custo similar aos adsorventes porosos (5 - 10 µm), mas têm menor capacidade e, por isto, o seu emprego tem diminuído notavelmente nos últimos anos (Figura 2).

Figura 1- Formas mais comuns de partículas para cromatografia de líquidos.

Figura 2- Diferentes formas e tamanhos dos materiais para empacotamento de colunas.

Para obter distribuição homogênea do recheio em toda extensão da coluna, o que aumenta a eficiência da separação, as partículas devem ter a menor variação de diâmetro possível. As partículas esféricas são melhores do que as irregulares, mas estas têm menor custo.

O tamanho da partícula controla o processo de difusão das moléculas da amostra ao penetrar e sair dos poros da partícula. Quanto maior o tamanho da partícula porosa, mais lento o processo de difusão e, como conseqüência, mais lenta a transferência de massa entre a fase estacionária e a fase móvel. Isto acontece porque, à medida que aumenta o tamanho da partícula, aumenta também a profundidade dos poros e conseqüentemente a amostra demora mais tempo para sair destes poros profundos. Ao mesmo tempo deve-se considerar que um aumento da vazão da fase móvel, para obter-se análises rápidas, faz com que as moléculas da amostra nesta fase migrem rapidamente, em comparação com as da fase estacionária (independente dos poros). Isto resulta no alargamento dos picos. Conforme diminui o tamanho da partícula, a profundidade dos poros diminui e a saída dos poros acontece mais rapidamente, permitindo obter análises rápidas, sem perda na eficiência.

Estas explicações justificam porque na CLAE utilizam-se somente materiais porosos cujas partículas tem tamanho menor do que 30 µm, com exceção da troca iônica.

Outros tipos de materiais utilizados são partículas esféricas, geralmente vítreas, não porosas, recobertas por uma camada muito fina de um adsorvente poroso. Este tipo de material e denominado de película de camada porosa, de porosidade superficial ou de centro não poroso. A Tabela 3, apresenta um resumo das propriedades gerais dos recheios peliculares e porosos em função dos tamanhos de suas partículas.

Tabela 3- Características de diferentes recheios para CLAE.

Propriedade Irregulares

( > 30 µm)Porosos Esféricos ( > 30 µm)

Esféricos ou Irregulares (5 ou 10µm)

Peliculares esféricos ( > 30 µm)

EficiênciaBaixa a moderadaBaixa a moderadaAltaModerada a alta Velocidade de análise Moderada Moderada Rápida Rápida Facilidade de enchimento Razoável Boa Razoável Excelente Quantidade de amostra Grande Grande Grande Pequena Permeabilidade da colunaAltaAltaBaixaMuito alta Capacidade Alta Alta Alta Baixa CustoBaixoModeradoAltoModerado a alto

4- AS TÉCNICAS DA CLAE

Há cinco tipos de fases estacionárias com diferentes mecanismos que regem as separações cromatográficas na CLAE. Mediante a simples troca de coluna e fase móvel é possível utilizar um deles.

4.1- CROMATOGRAFIA LÍQUIDO-SÓLIDO OU POR ADSORÇÃO

O mecanismo de separação da cromatografia líquido sólido (CLS), ou adsorção, se baseia na competição que existe entre moléculas da amostra e as da fase móvel em ocupar os sítios ativos na superfície de um sólido (fase estacionária). O equilíbrio estabelecido é:

Para que a molécula do soluto possa ser adsorvida na fase estacionária, primeiro uma molécula da fase móvel deve ser deslocada da superfície. Se assumir que o adsorvente possui uma superfície polar (por exemplo: sílica ou alumina), grupos apolares (por ex.; hidrocarbonetos) terão pouca afinidade por essa superfície e não irão deslocar a molécula da fase móvel; por isso, não serão retidos. Grupos funcionais polares capazes de formar pontes de hidrogênio terão fortes afinidades pela superfície e serão fortemente retidos. Moléculas polarizáveis (por ex.: moléculas aromáticas) irão apresentar interação dipolo induzido-dipolo com a superfície do adsorvente e, portanto, também serão retidas; o grau de retenção depende da polarização de cada molécula ou grupo funcional. É importante que as partículas da fase estacionária apresentem uma grande área de superfície, isto é, um grande número de sítios ativos. A atividade da superfície de muitos sólidos (incluindo a sílica e alumina) se encontra com freqüência afetada pela retenção de certas moléculas de alta polaridade como álcoois, fenóis, água, etc., e, devido a eles, em determinadas ocasiões, é difícil reproduzir os resultados obtidos nas análises, porque as propriedades da superfície sofrem mudanças. Em conseqüência, a superfície da sílica empregada na CLAE é habitualmente submetida a determinados processos de desativação com o propósito de diminuir a retenção de moléculas muito polares e, assim, se mantém a superfície em condições uniformes, o que contribuirá para melhorar a reprodutibilidade das análises. Muitas vezes, devido a uma forte adsorção ou retenção de alguns componentes da amostra no sólido ativo, é necessário aumentar a polaridade da fase móvel de uma maneira constante e uniforme, com o qual se consegue um incremento de solubilidade dos componentes da amostra na fase móvel. A essa variação dá-se o nome de eluição por gradiente ou programação da fase móvel.

Para a maioria das separações realizadas por adsorção (CLS) usa-se partículas porosas, na faixa de 5-10 µm, alem de se empregar, às vezes, os materiais maiores (30-40 µm), como película porosa. Quase todas estas separações são limitadas a alguns tipos de adsorventes: sílica e alumina. A retenção e a separação nestes adsorventes são geralmente similares, os componentes mais polares da amostra serão retido preferencialmente.

Na modalidade de cromatografia por partição com fase líquida, é preferível usar suportes que sejam inertes; mas não existem suportes inertes com rigidez e uniformidade requeridas pela CLAE. Usa-se a sílica, sabendo-se que tem pontos adsorventes que necessitam ser completamente cobertos ou inativados, como em CG. Os poros deverão ser suficientemente grandes para permitir total acesso das moléculas do soluto à fase estacionária contida dentro da estrutura dos poros, mas suficientemente pequeno para resistir a remoção do líquido estacionário pelo arraste mecânico da fase móvel.

A Tabela 4 apresenta uma lista de sólidos microporosos usados em cromatografia líquido sólido (CLS) e como suporte para cromatografia líquido-líquido (CLL).

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