ensaios imunologiacos

ensaios imunologiacos

(Parte 6 de 6)

Sobrevivência

Proliferação

Céls.Tronco

Cromossomos (linhagem 1)

C. 1. 2. 3.

CAP. 20 - ENSAIOS IMUNOLÓGICOS

Estes genes introduzidos podem apresentar três destinos diferentes na célula: ausência de inserção, inserção aleatória e inserção por recombinação homóloga. Desta forma, apenas uma pequena população das células apresenta o gene inserido de forma correta, ou seja, os que apresentaram recombinação homóloga; para que ocorra seleção destas células, elas são cultivadas em meio contendo neomicina e ganciclovir, como acima referido.

O resultado desta cultura em meio contendo neomicina e ganciclovir é o seguinte:

! As células que não tiveram o gene inserido, são sensíveis a neomicina e morrem (Figura 22C1). ! As células que apresentam inserção aleatória, não perdem o gene da tk e são sensíveis ao ganciclovir e morrem (Figura 22C2).

! As células que sofreram recombinação homóloga do gene mutado apresentam resistência a neomicina e por não expressarem a tk são resistentes ao ganciclovir e sobrevivem (Figura 22C3).

Na próxima etapa, estas células sobreviventes são inseridas in vitro em blastocisto de camundongo fêmea de cor de pelagem diferente (linhagem 2) daquela da qual foram coletadas as células embrionárias (linhagem 1) (Figura 23A). Após a introdução das células no blastocisto, este é inserido em camundongos fêmea na qual foi induzida a gravidez hormonal. O blastocisto desenvolve-se e origina uma prole formada por camundongos quiméricos, ou seja, apresentando características das duas linhagens. A utilização de camundongos de pelagens diferentes é importante para a identificação dos camundongos quiméricos que herdaram os genes mutantes: estes apresentam um padrão mesclado de cor de pelagem. Por exemplo, as células embrionárias (linhagem 1) podem ser oriundas de camundongos de pelagem marrom enquanto que o blastocisto de fêmeas de pelagem negra (linhagem 2). Os camundongos quiméricos apresentam a cor negra mesclada com faixas marrons e são heterozigotos para o gene mutado. Estes camundongos quiméricos são cruzados com camundongos normais, para que seja obtida uma linhagem homozigota para o gene mutante (Figura 23B).

Figura 23 – Obtenção de camundongos nocauteados A. Inóculo das Células Tronco Embrionárias de camundongo marrom em blastocisto de fêmeas pretas B. cruzamento dos camundongos quiméricos

Blastocisto Células tronco Reimplante do blastocisto em fêmea pseudo-grávida

Filhote quimérico

Cromossomos (linhagem 2) Cromossomo com gene mutado

Cromossomos normais

Cromossomo mutado

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