ensaios imunologiacos

ensaios imunologiacos

(Parte 4 de 6)

%F1/F2+

Campos eletromagnéticos

Detector de comprimento de onda e analisador

Raio Laser

CAP. 20 - ENSAIOS IMUNOLÓGICOS

Estas células podem ser reutilizadas para outros ensaios porque são mantidas a integridade e a esterilidade da amostra.

4. Ensaios imunoenzimáticos (ELISA - Enzyme-linked Immunoabsorbent Assay) e radioimunoensaios (RIA-Radio-Immuno Assay)

Os ensaios imunoenzimáticos e os radioimunoensaios apresentam os mesmos princípios técnicos com a diferença que no primeiro, a revelação da reação é realizada com anticorpos marcados com enzima, como na imunoperoxidase, e no segundo, a revelação é realizada com anticorpos marcados com isótopos radioativos (geralmente 125I ou 131I). Pelos efeitos deletérios da radiação, os radioimunoensaios estão sendo substituídos pelos ensaios imunoenzimáticos.

Estes métodos podem ser utilizados para a detecção de antígenos (hormônios, drogas, marcadores tumorais, alérgenos) e de anticorpos (contra bactérias, vírus, fungos e protozoários). A sensibilidade de detecção destes ensaios é na ordem de nanogramas (ng) ou picogramas (pg).

Será dada ênfase aos ensaios de ELISA, e dentre as variações empregadas na realização deste, serão focalizados os do tipo indireto e de captura. O método indireto propicia a detecção de anticorpos na amostra enquanto que no de captura são detectados antígenos, que podem ser inclusive Imunoglobulinas.

Estas técnicas são geralmente realizadas em placas de poliestireno de 96 poços, o que propicia a utilização de um maior número de amostras num único ensaio (Figura 17).

No método indireto, as placas são pré-incubadas com os antígenos contra os quais se quer detectar a produção de anticorpos; atualmente compram-se placas contendo alguns tipos de antígenos já padronizados (Figura 17A). Depois da pré-incubação, as placas devem ser lavadas para retirar os antígenos não aderidos e incubadas com soluções proteícas (leite desnatado, gelatina, albumina sérica bovina, caseína) para bloquear os locais não ocupados pelos antígenos. Esta etapa é importante porque como estas placas apresentam capacidade de adsorver proteínas, os anticorpos ou outras moléculas presentes nos líquidos analisados podem se associar à placa e alterar os resultados. Após o bloqueio, as amostras de soro/plasma são incubadas, por períodos de tempo e temperatura padronizados (Figura 17B); em seguida, as placas são lavadas para retirar os anticorpos não específicos e incubadas com anticorpos específicos para o primeiro anticorpo, marcados com uma enzima (fosfatase alcalina, por exemplo) (Figura 17C).

294 Figura 17 - ELISA

Placa de 96 cavidades A. Sensibilização da placa com o Ag

Lavagem

B. Adição do primeiro anticorpo

Lavagem

C. Adição do anticorpo marcado com enzima (ELISA) ou radioisótopo (RIA)

Lavagem

D. ELISA - adição do substrato e cromógeno

E. Reação enzimática - reação colorida – leitura da Densidade Óptica (DO) no espectrofotômetro

1 23 4 5 6 7 8 9 10 1 12

Curva padrão Amostras

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 12

CAP. 20 - ENSAIOS IMUNOLÓGICOS

A revelação da reação antígeno-anticorpo é feita pela incubação com o substrato da enzima e com os doadores de hidrogênio, sendo os mais comumente utilizados o ácido 5-aminosalicílico (castanho), o 2,2’-diazino (3-etilbenzotiazolino–6- ácido sulfônico-ABTS) (verde) e a tetrametilbenzidina-TMB (azul) (Figura 17D). A intensidade da cor no final da reação é proporcional a concentração dos anticorpos presentes na amostra (Figura 17E); e por isso este ensaio é colorimétrico.

A leitura da intensidade da cor é obtida em espectrofotômetros, adaptados à leitura de placas, e estes resultados são dados em Densidade Óptica (DO), a qual é proporcional à concentração de anticorpos na amostra. Além das amostras dos pacientes, estes ensaios devem utilizar como controle anticorpos específicos, de concentração conhecida, de forma que se possa quantificar a concentração de anticorpos presentes nas amostras (curva - padrão). Tendo-se a curva - padrão onde se tem a correlação entre concentrações conhecidas do anticorpo com a DO, pode-se calcular a partir das DOs de soros dos pacientes, a concentração de anticorpos específicos. Como exemplo, examinemos a Figura 18.

Figura 18 – Curva padrão Curva Padrão

Concentração do Anticorpo (mg/ml)

DO (x n m

Na Figura 18, temos na tabela as concentrações de um anticorpo padrão (entre 2 e 0,25mg/ml) e as correspondentes DOs; estes resultados propiciam que se tenha uma curva - padrão, a partir da qual, através da análise de regressão linear (por exemplo, Programa GraphPad Prism), pode-se calcular as concentrações x e y, cujas DOs são conhecidas. Na curva - padrão, a linha azul foi obtida a partir dos dados de DOs e a concentração de anticorpos e a linha vermelha corresponde ao resultado da análise de regressão linear, que nos dá a segurança de que existe realmente uma correlação linear entre os dois dados. A análise de regressão linear proporciona um índice de correlação entre os dados, o qual deve ser

Concentração (mg/ml) DO

2 1 1 0,694 0,5 0,347 0,25 0,168 X 0,894 Y 0,325 o mais próximo possível de 1,0, o que indica uma boa correlação entre os dados analisados. No caso da Figura 18, o índice de correlação da curva foi de 0,99071, o que nos indica que existe uma correlação linear entre a DO e as concentrações de anticorpos. A partir da equação obtida, tem-se que os valores desconhecidos X e Y correspondem às concentrações de anticorpos de 1,73 e 0,503 mg/ml, respectivamente.

No método de captura (ou ELISA sanduíche), anticorpos específicos são aderidos à placa e a amostra contendo a molécula a ser reconhecida (hormônio, citocina, droga, Imunoglobulina, antígenos tumorais ou alérgenos) é colocada. Após os procedimentos normais de incubação e de lavagem, a placa é incubada com um soro policlonal marcado com enzima, que reconhece o antígeno associado ao anticorpo aderido à placa. Esta técnica é chamada de sanduíche porque o antígeno fica entre dois anticorpos, o aderido à placa e o anticorpo marcado com a enzima. Neste tipo de técnica quando o anticorpo aderido à placa é monoclonal deve-se ter o cuidado do segundo anticorpo marcado ser policlonal ou um monoclonal que reconheça um epítopo diferente do reconhecido pelo primeiro anticorpo.

5. Western Blotting

O termo blotting significa, em biologia molecular, transferir macromoléculas de um meio semi-sólido como o gel de poliacrilamida para um papel de filtro. A primeira técnica deste tipo descrita foi o Southern Blotting, na qual são transferidas moléculas de DNA; este nome foi dado à técnica por causa do sobrenome do cientista que a descreveu – E.M.Southern. Como uma brincadeira, a técnica descrita para a transferência de RNA foi denominada Northern Blotting e para proteínas, Western Blotting. A técnica de Western Blotting permite que peptídeos antigênicos sejam separados, por Peso Molecular (entre 5.0 e 250.0 daltons), e reconhecidos por anticorpos específicos. Vários antígenos, principalmente os patógenos, já são conhecidos em termos moleculares e apresentam um padrão característico de peptídeos e portanto, pode-se identificar, com alto grau de precisão, se um indivíduo apresenta uma infecção com um determinado tipo de patógeno.

Na técnica de Western Blotting, peptídeos oriundos de um antígeno, por exemplo, dos HIV são separados por eletroforese em gel de poliacrilamida contendo um detergente aniônico - o SDS (dodecil sulfato de sódio) (Figura 19). O SDS associa-se às regiões hidrofóbicas das proteínas conferindo-lhes cargas negativas, o que propicia a migração na eletroforese de acordo com o PM. Após a eletroforese, os peptídeos separados são transferidos por capilaridade (blotting) ou por corrente elétrica (eletroforese) para um papel de nitrocelulose. O papel de nitrocelulose apresenta a partir deste procedimento uma

CAP. 20 - ENSAIOS IMUNOLÓGICOS cópia dos antígenos que foram separados no gel e durante esta passagem do gel para o papel, o SDS é deslocado das proteínas e os determinantes antigênicos nativos são re-expostos. Na etapa seguinte, o papel contendo os peptídeos isolados é incubado com o soro dos pacientes em análise. Após lavagem, para a retirada dos anticorpos não associados, as fitas são incubadas com um soro anti-Ig humana marcado com uma enzima, com o substrato e o cromógeno. Quando o paciente apresenta anticorpos contra os peptídeos isolados, após a revelação pelo cromógeno, aparecem bandas (manchas) nos locais onde os anticorpos específicos se associaram. Além da revelação enzimática, podem ser utilizados anticorpos marcados com radioisótopos e assim o papel é submetido a autoradiografia (revelação com emulsão fotográfica), para que sejam visualizadas as bandas.

Na figura 19, temos três padrões de resultado:

! No papel de nitrocelulose referente ao paciente 1 estão presentes bandas nos locais correspondentes às proteínas de PM 120, 64, 5, 41, 3, 24 e 18 kD, demonstrando que apresenta anticorpos que reconhecem todos os componentes do HIV (Capítulo 19).

! O papel de nitrocelulose referente ao paciente 2 não apresenta bandas o que significa que este não apresenta anticorpos específicos contra os peptídeos presentes na fita.

! O papel de nitrocelulose referente ao paciente 3 apresenta banda apenas no local correspondente à p24, o que pode sugerir, que ele tenha uma infecção por um outro retrovírus, com peptídeos similares ao do HIV ou outro tipo de microorganismo que apresenta uma proteína de 24 kD.

1. Cultura de células e ensaios de proliferação

A grande maioria dos conhecimentos relativos à ativação celular, indução de citocinas, moléculas co-estimulatórias e outras tem sido obtidos com células cultivadas in vitro. Vários destes mecanismos têm sido, nos últimos anos, comprovados em sofisticados modelos in vivo utilizando animais nocauteados (nos quais genes foram inativados) e transgênicos (nos quais genes foram implantados).

Figura 19 – Western Blotting A. Gel de separação, B. Tanque de Blotting (transferência para papel de nitrocelulose), C. Incubação com soro de paciente, Ig marcada e substrato, D. Visualização dos resultados

A2 A3 Soro dos pacientes

A1 Lavagem A1 A2 A3

+anti-Ig humana marcada com enzima + substrato + cromógeno

Polo -

Polo +

Amostras –Ags do HIV

Peptídeos separados

(Parte 4 de 6)

Comentários