ensaios imunologiacos

ensaios imunologiacos

(Parte 1 de 6)

CAPÍTULO 20

Os ensaios imunológicos foram e têm sido os principais responsáveis pelo conhecimento que se tem do sistema imune. Além deste aspecto relacionado ao conhecimento científico básico, estes ensaios são importantes, na clínica, para a detecção de infecções, de doenças auto-imunes e de estados de imunodeficiência. Os ensaios imunológicos podem ser utilizados não só para detectar a produção de anticorpos bem como para detectar a presença de antígenos, diferenciar o estágio de uma doença de acordo com a classe de Ig produzida, selecionar doadores e receptores de órgãos para transplantes, avaliar o prognóstico da doença, da eficácia de um tipo de terapia, dentre outros.

Nos últimos anos, houve uma grande evolução no sentido de que com a técnica de anticorpos monoclonais (produzidos por um único clone celular) podem ser obtidos anticorpos altamente purificados e específicos, tais como os anticorpos anti-CD4 e anti-CD8, que identificam respectivamente linfócitos T auxiliares e citotóxicos. Além dos anticorpos, os antígenos também são produzidos por meio de técnicas de síntese proteíca e de recombinação, propiciando que antígenos purificados possam ser utilizados nas técnicas de ELISA, por exemplo.

Os ensaios imunológicos podem ser realizados por meio de técnicas não quantitativas, visualizadas por meio de reações de precipitação e aglutinação ou podem ser quantitativas, com utilização de marcadores enzimáticos (ELISA, imunoperoxidase, citometria de fluxo) ou radioisótopos (Radioimunoensaio).

Os testes de precipitação e aglutinação têm menor sensibilidade que os imunoenzimáticos, porque os complexos Antígeno-Anticorpo para serem visualizados devem apresentar um tamanho

CAP. 20 - ENSAIOS IMUNOLÓGICOS adequado (ver abaixo). Os testes de precipitação são utilizados para a detecção de antígenos solúveis (proteínas, glicoproteínas) enquanto que os de aglutinação para a detecção de antígenos particulados (hemácias, bactérias, células diversas).

O ensaio de precipitação é utilizado para detectar os anticorpos produzidos contra antígenos solúveis em concentrações entre 20 e 2 mg/ml. Para que a reação de precipitação seja visível deve haver uma relação de equivalência entre as concentrações do antígeno e do anticorpo. Em caso de excesso de antígeno ou de anticorpo ocorre uma redução na formação do precipitado. Quando as concentrações de antígeno e anticorpo são equivalentes, formam-se complexos de tamanho que permite a sua visualização; nestas concentrações encontra-se a zona de equivalência (Figura 1A). Quando o plasma ou soro a ser analisado apresenta uma alta concentração de anticorpos, estes se associam aos antígenos, formando pequenos complexos, não visualizados por precipitação; nesta concentração de anticorpos ocorre o efeito de pró-zona (Figura 1B). Quando o anticorpo está pouco concentrado em relação ao antígeno, também são formados pequenos complexos e ocorre o efeito denominado de pós-zona (Figura 1C).

Título do anticorpo

Quando os ensaios não são quantitativos, a produção de anticorpos contra um determinado antígeno pode ser correlacionada às diluições dos soros utilizadas para a realização do teste. Nestes ensaios, as partículas antigênicas são misturadas com diferentes diluições do soro do paciente e considera-se como resultado de produção de anticorpos a maior diluição em que ocorre a visualização (precipitação ou aglutinação) da reação antígeno-anticorpo. A esta diluição dá-se o nome de título do anticorpo. Por exemplo, suponhamos que vamos estudar a produção de anticorpos contra espécies de Leishmania, que causam calazar, em uma população de área endêmica, no Brasil. É comum ser observada aglutinação de formas promastigotas de Leishmania até a diluição de 1:600 (título) na maioria das pessoas porque a infecção com diversos parasitas (Trypanosoma, Schistosoma, Plasmodium, Leishmania que causa a forma mucocutânea) induz a produção de anticorpos que apresentam reação cruzada com Leishmania donovani. Por outro lado, o soro de pacientes infectados, que apresentam calazar, aglutina as formas promastigotas até a diluição de 1:6.400 (título). Como pode ser observado, neste exemplo, o título de anticorpos contra Leishmania nas pessoas da região endêmica é de 1:600 enquanto que nas pessoas infectadas este aumenta mais de dez vezes.

274 Figura 1 – Reação de Precipitação: A. Ponto de Equivalência, B. Efeito de Pró-zona e C. Efeito de Pós-zona

Ac1

Ac2 Ag

Ac1

Ac2 Ac1

Ac2

CAP. 20 - ENSAIOS IMUNOLÓGICOS

1. Teste do anel ou ring test

Um dos testes mais rápidos e simples, utilizado em laboratórios de pesquisa, é o teste do anel ou ring test. Utiliza-se este teste quando o objetivo é saber se um animal está produzindo anticorpos contra um determinado antígeno solúvel, durante o processo de imunização. Suponhamos que estamos imunizando um coelho com Igs isoladas do soro de camundongos. Depois de algumas semanas, podemos colher o soro do coelho e colocá-lo cuidadosamente num tubo de vidro e sobre este uma solução do antígeno, no caso as Igs de camundongo (Figura 2B). Quando o animal produziu anticorpos específicos contra o antígeno, após alguns minutos, surge na interface entre as duas soluções, quando é atingida a equivalência, um precipitado, visível a olho nu,. Pode-se utilizar como controle negativo, o soro do animal colhido antes da imunização; neste caso, não haverá a formação da linha de precipitação na interface entre o soro e o antígeno (Figura 2A).

Figura 2 – Ensaio do Anel A. Reação Negativa: soro antes da imunização, B. Reação Positiva: soro pós-imunização

2. Imunodifusão

A técnica de imunodifusão é realizada em meio semi-sólido, geralmente o ágar ou agarose, que permite uma difusão mais homogênea que em meio líquido, mas que tem o inconveniente de demorar entre 18 e 24 horas para que seja observada a precipitação. A difusão dos imunoprecipitados no gel depende do tamanho destes; quando são grandes ficam maior que o diâmetro dos poros, o que impede a sua difusão. A imunodifusão pode ser simples ou dupla; é simples, quando ou o antígeno ou o anticorpo é fixado a um suporte e o outro componente se difunde no meio, até ocorrer precipitação; é dupla, quando os dois componentes migram um em direção ao outro.

Ag1 Soro

Ag1

Soro Linha de precipitação

A imunodifusão dupla pode ser realizada numa lâmina de microscópio revestida de ágar, contendo orifícios onde são colocadas concentrações de Ag e Ac (Figura 3). Quando o Ag e os anticorpos específicos encontram-se, em concentrações correspondentes à zona de equivalência, são formados complexos precipitantes.

Figura 3 – Imunodifusão dupla

Na figura 3, observa-se que o antígeno X precipitou próximo ao orifício, onde ele foi depositado, enquanto que os antígenos Y e Z, precipitaram na região média entre os orifícios onde foram depositados o antígeno e o anticorpo. O fenômeno observado com o antígeno X, pode ter várias explicações: o antígeno pode estar em baixas concentrações e a zona de equivalência, ocorreu próximo ao orifício onde foi depositado ou o PM ou a carga do antígeno interferiu na sua capacidade de migração.

3. Imunodifusão dupla, segundo Ouchterlony

O método de imunodifusão, segundo Ouchterlony, é utilizado quando se deseja identificar um antígeno comparando-o a outros já conhecidos. Nas lâminas ou placas de Petri, revestidas de ágar, são feitos orifícios adjacentes: em um destes orifícios é colocado o soro e nos outros, o antígeno de origem conhecida e aquele a ser identificado (Figura 4). Nesta figura, observa-se que existem três padrões de resultado conforme a relação estrutural entre o antígeno conhecido (padrão) e o que se quer analisar. Quando o antígeno conhecido (HSA – Albumina Sérica Humana) é similar ao analisado (Antígeno A), os anticorpos e os antígenos migram, formando uma linha de precipitação contínua, na concentração correspondente à zona de equivalência (Figura 4A). Quando os antígenos são semelhantes mas não idênticos, é formado um esporão; na figura 4B, por exemplo, os anticorpos reconhecem o antígeno padrão (HSA) e o A2 (BSA – Albumina Sérica Bovina), que são similares; no entanto, o esporão

Ag X Ags Y e Z Antisoro Lâmina revestida de agar

Migração no agar

CAP. 20 - ENSAIOS IMUNOLÓGICOS corresponde aos determinantes antigênicos, reconhecidos pelos anticorpos anti-HSA, presentes apenas no HSA. Quando os anticorpos reconhecem os dois antígenos mas estes são distintos (HSA e HGG – Gamaglobulina Humana), são observadas duas linhas que se cruzam, formando dois esporões, o que demonstra que determinantes antigênicos diferentes presentes nestes antígenos são reconhecidos pelos anticorpos (Figura 4C). A presença de mais de uma linha de precipitação significa que os anticorpos estão reconhecendo outros componentes e que a solução antigênica não está purificada.

Este é um método semi-quantitativo, de baixa sensibilidade, ainda utilizado para caracterizar antígenos em processos infecciosos ou anticorpos em doenças auto-imune. Uma das limitações deste teste é o tempo (18-24 horas) requerido para a obtenção dos resultados, além de detectar apenas reações Ag-Ac nas quais há formação de precipitados. Atualmente, este teste tem sido substituído por ensaios imunoenzimáticos.

Figura 4 – Imunodifusão de Ouchterlony

4. Imunodifusão radial simples

A imunodifusão radial simples, introduzida por Mancini, em 1965, além de ser uma técnica de fácil realização e de baixo custo, é quantitativa. É realizada em placas ou lâminas revestidas de ágar, no qual é incorporado um antisoro específico para a molécula a ser quantificada (Figura 5B). No gel de ágar são feitos orifícios onde são depositadas pelo menos três concentrações conhecidas da molécula estudada (solução padrão) e as amostras de concentração desconhecida. Estas moléculas difundem-se no ágar e quando reagem com o anticorpo, na concentração correspondente à zona de equivalência, forma-

Soro anti-HSA esporão

Soro anti-HSA Soro anti-HSA e anti-HGG

Ag A HSA Ag A2 HSA Ag B

Resultado: Ag A = HSA

Identidade Total

Ag A2 = BSA

Identidade parcial

Ag B = HGG Não identidade se a linha de precipitação, o que ocorre entre 48-72 horas. O diâmetro do halo que se forma ao redor do orifício onde foram depositadas as amostras corresponde à concentração da molécula, de acordo com a curva padrão obtida (Figura 5A). Para a obtenção da curva padrão são utilizadas concentrações conhecidas da solução padrão e após reação com os anticorpos presentes no ágar, os halos são medidos. Por exemplo, se quisermos dosar as concentrações de IgM do soro de pacientes; para a obtenção da curva padrão deve-se ter uma solução contendo IgM purificada de concentração conhecida.

Esta técnica é utilizada para quantificar IgG, IgM e IgA e moléculas do sistema Complemento. Figura 5 – Imunodifusão radial simples A. Curva padrão, B. Placa com concentrações do Ag e da solução padrão diâmetro do anel (m)

5. Imunoeletroforese

A imunoeletroforese é um método qualitativo que combina as técnicas de eletroforese e imunodifusão. A associação das duas técnicas permite que um maior número de componentes antigênicos de um líquido biológico (soro, urina) sejam identificados; no caso do soro, mais de 30 componentes são identificados pela imunoeletroferese enquanto que na eletroforese entre 5 e 6 o são.

É realizada também em lâminas ou placas de vidro recobertas de ágar, onde são feitos orifícios e canaletas para a colocação dos reagentes. Na primeira etapa, que geralmente dura entre 60-90 minutos, a solução antigênica é colocada num orifício do ágar e a lâmina é submetida à eletroforese. Nesta fase, os componentes antigênicos são separados de acordo com as suas cargas elétricas. Vários fatores dos componentes antigênicos (além da carga elétrica, o tamanho, a forma e a concentração), do

A. Gel contendo anticorpo

Diluições do Ag

(Parte 1 de 6)

Comentários