Técnicas de análise instrumental

Técnicas de análise instrumental

1. VOLTAMETRIA

 

        A voltametria compreende um grupo de métodos eletroanalíticos nos quais a informação sobre o analito é obtida através de medidas de correntes em função do potencial aplicado e em condições que estimulam a polarização de um eletrodo indicador ou de trabalho. Geralmente, para aumentar a polarização, os eletrodos de trabalho na voltametria são microeletrodos com áreas superficiais máximas de alguns poucos milímetros quadrados e, em algumas aplicações, de poucos micrometros quadrados ou menos.

 A voltametria está baseada na medida de uma corrente que se desenvolve em uma célula eletroquímica sob condições de polarização completa por concentração. Ao contrário, as medias potenciométricas são feitas com correntes que se aproximam de zero e nas quais a polarização está ausente. Na voltametria ocorre o consumo mínimo do analito.

 

 

    1. 1.1FUNDAMENTOS 

 

Historicamente, o campo da voltametria se desenvolveu a partir da polarografia, que é um tipo particular de voltametria que foi descoberto pelo químico Jaroslav Heyrovsky no início dos anos 1920. A polarografia que ainda é um ramo muito importante da voltametria difere de outros tipos de voltametria porque o microeletrodo tem a forma de um eletrodo gotejante de mercúrio(DME).

A voltametria é largamente usada pelos químicos inorgânicos, físico-químicos e bioquímicos para finalidades não-analíticas, incluindo estudos fundamentais de processos de redução e oxidação em vários meios, processos de adsorção em superfícies, mecanismo de transferência de elétrons em superfície de eletrodos quimicamente modificada.

O advento dos amplificadores operacionais de baixo custo permitiu o desenvolvimento comercial de equipamentos relativamente baratos que incorporaram muitas dessas modificações e as disponibilizaram para os químicos. O resultados foi o ressurgimento recente do interesse em aplicações de métodos voltamétricos para a determinação de muitas espécies, particularmente de interesse farmacológico, ambiental e biológico. Além disso, a voltametria acoplada a cromatografia líquida de alta eficiência tornou-se uma poderosa ferramenta para a análise de misturas complexas de diferentes tipos. A voltametria moderna também continua a ser uma potente ferramenta usada por químicos interessados no estudo de processos de oxidação e redução, assim como em processos de adsorção.

 

 

1.2 INSTRUMENTAÇÃO

 

A célula é constituída de três eletrodos imersos em uma solução contendo o analito e também um excesso de eletrólito não-reativo chamado eletrólito suporte. Um dos três eletrodos é o microeletrodo ou eletrodo de trabalho, cujo potencial varia linearmente com o tempo. Suas dimensões são mantidas pequenas para aumentar sua tendência a tornar-se polarizado. O segundo eletrodo é um eletrodo de referencia cujo potencial permanece constante durante o experimento. O terceiro eletrodo é um contra-eletrodo, que geralmente é um fio enrolado de platina ou um poço de mercúrio que simplesmente serve para conduzir eletricidade da fonte de sinal através da solução para o microeletrodo. A fonte de sinal é um gerador de voltagem de varredura linear similar ao circuito integrado.

 

 

 

Figura 1 – Sistema para voltametria potenciostática de varredura linear com três eletrodos.

 No início, a voltametria era feita com um sistema de dois eletrodos e não com três, como mostra a Figura 1. Com um sistema de dois eletrodos, o segundo eletrodo deve ser ou um eletrodo metálico grande, como u poço de mercúrio, ou um eletrodo de referência grande o suficiente para impedir sua polarização durante um experimento. Quase todos os trabalhos de voltametria são feitos agora com o sistema de três eletrodos.

 

 

1.3 MICROELETRODOS

 

 Os microeletrodos empregados em voltametria têm vários formatos e tamanhos. Com freqüência, são discos pequenos de um condutor que é prensado em um cilindro de material inerte, como Teflon ou Kel-F que tenha embebido em si um fio para contato, como é mostrado na Figura 2. O condutor pode ser um metal inerte como platina ou ouro, grafite pirolítico ou carbono vítreo, um semicondutor como óxido de estanho ou óxido de índio, ou ainda um metal recoberto com um filme de mercúrio.

 
Figura 2 – Eletrodo em disco.
 

 Os microeletrodos de mercúrio têm sido amplamente empregados em voltametria por várias razões. Uma delas é a faixa de potencial negativo relativamente ampla. Além disso, uma nova superfície metálica é formada rapidamente, simplesmente pela produção de uma nova gota, e isso é importante porque as correntes medidas em voltametria são bastante sensíveis à limpeza e a ausência de irregularidades. Uma vantagem adicional dos eletrodos de mercúrio é que muitos íons metálicos são reduzidos reversivelmente a amálgamas na superfície de um eletrodo de mercúrio, o que simplifica a química do processo. Microeletrodos de mercúrio podem ter várias formas. O mais simples é um filme de mercúrio formado pela eletrodeposição do metal sobre um eletrodo cilíndrico, como mostrado na Figura 2, ou também o eletrodo de gota pendente de mercúrio, ilustrado na Figura 3.

 

 

 

 

 

 

 

Figura 3 – Eletrodo gotejante de mercúrio.

 

 O eletrodo gotejante de mercúrio(DME) - Figura 3 - típico usado em primeiros experimentos de polarografia, consiste em um tubo capilar fino(diâmetro interno de aproximadamente 0,05 mm) de uns 10 cm de comprimento, colocado na base de uma coluna de mercúrio de uns 50 cm de altura. O diâmetro do capilar é tal que uma nova gota se forma e é solta em intervalos de 2 a 6 segundos. O diâmetro da gota varia de 0,5 a 1 mm e é altamente reprodutível. Em algumas aplicações, o tempo do gotejamento é controlado por um martelo mecânico que desaloja a gota a um determinado tempo após o início da sua formação.

 O eletrodo que está disponível comercialmente consiste de um tubo capilar muito fino conectado a um reservatório de mercúrio, como ilustrado na Figura 4. O metal é formado para fora do capilar por um pistão controlado por uma rosca micrométrica. Esse micrômetro permite a formação de gotas com áreas que são reprodutíveis em cinco por cento ou ainda melhor.

 

 

Figura 4 Eletrodo de mercúrio de gota pendente.

 

A Figura 5 mostra um eletrodo de mercúrio disponível comercialmente que pode ser operado como eletrodo gotejante ou como eletrodo de gota pendente. O mercúrio gotejante ou como eletrodo de gota pendente. O mercúrio está contido em um reservatório de plástico de 25cm acima da extremidade do capilar. Uma mola de compressão força o êmbolo com a ponta de poliuretano contra a cabeça do capilar, impedindo assim o fluxo de mercúrio. Esse êmbolo é levantado por ativação do solenóide por um sinal do sistema de controle. O capilar tem diâmetro muito maior do que capilares típicos, por isso a formação da gota é extremamente rápida.

 

Figura 5 – Eletrodo de mercúrio de gota estática.

 

1.4 VOLTAMETRIA HIDRODINÂMICA

 

A voltametria hidrodinâmica é realizada de vários modos. Um método envolve agitação vigorosa da solução em contato com um microeletrodo fixo. A agitação é feita com agitador magnético comum. Alternativamente, o microeletrodo sofre rotação com uma velocidade alta e constante na solução, propiciando a agitação como mostra a Figura 6a. Um outro modo de realizar a voltametria hidrodinâmica envolve fazer com que a solução do analito flua através de um tubo no qual esteja montado o microeletrodo (Figura 7). Essa técnica está sendo muito usada para a detecção de analitos oxidáveis ou redutíveis à medida que saem de uma coluna de cromatografia líquida.

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 6 – (a) vista lateral de um eletrodo rotatório na forma de disco, mostrando o padrão de fluxo da solução. (b) Vista da base de um eletrodo com forma de disco. (c) Vista da base de um eletrodo do tipo anel-disco.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 7 – Um sistema voltamétrico para detecção de espécies eletroativas à medida que elas saem de uma coluna.

 

1.4.1 Aplicações de Voltametria Hidrodinâmica

 

Atualmente, as aplicações mais importantes de voltametria hidrodinâmica incluem: (1) detecção e determinação de espécies químicas à medida que elas saem de colunas cromatográficas ou de equipamentos para análise por injeção em fluxo: (2) determinação rotineira de oxigênio e de certas espécies de interesse bioquímico, como glicose, lactose e sacarose; (3) detecção do ponto final em titulações coutométricas e volumétricas; (4) estudos fundamentais de processos eletroquímicos.

 

1.5 VOLTAMETRIA CÍCLICA

 

O principal uso de voltametria cíclica é como ferramenta para estudos fundamentais e de diagnóstico que fornecem informação qualitativa sobre processos eletroquímicos em várias condições.

A voltametria cíclica, mesmo quando não usada em análises quantitativas rotineiras, tornou-se uma ferramenta importante para o estudo de mecanismos e velocidades de processos de oxidação/redução, particularmente em sistemas orgânicos e metalorgânicos. Esse método é normalmente a primeira técnica selecionada para a investigação de um sistema que pode ser tratado eletroquimicamente. Freqüentemente, os voltamogramas cíclicos revelarão a presença de intermediários em reações de oxidação/redução(veja Figura 8). Geralmente usa-se platina na construção de microeletrodos para essa técnica.

 

 

 

 

 

 

 

Figura 8 – Voltamograma cíclico do inseticida parathion em tampão pH 5 de acetato de sódio 0,5 M, 50% em etanol. Eletrodo de mercúrio de gota pendente. Velocidade de varredura: 200mV/s

 

 

1.6 POLAROGRAFIA

 

A polarografia foi o primeiro tipo de voltametria inventado e usado. Ela difere da voltametria hidrodinâmica em dois aspectos. Primeiro evita a convecção e segundo, um eletrodo gotejante de mercúrio, como o mostrado na Figura 6c, é usado como eletrodo de trabalho. Uma conseqüência da primeira diferença é que as correntes limites polarográficas são controladas comente por difusão, em vez de difusão e convecção. Como a convecção está ausente, as correntes limites polarográficas são geralmente uma ou mais ordens de grandeza menores dos que as correntes limites hidrodinâmicas.

Inicialmente, os métodos polarográficos estavam baseados em medidas de corrente em função do potencial aplicado a um eletrodo gotejante de mercúrio.

A corrente em uma célula contendo um eletrodo gotejante sofre flutuações periódicas correspondentes, em freqüência, à velocidade de gotejamento.

Na maioria dos experimentos, esse eletrodo era preso ao terminal negativo de uma fonte contínua e o potencial dessa fonte era aumentado linearmente até que a corrente aumentasse exponencialmente em conseqüência da redução do solvente ou do eletrólito suporte.

A Figura 9 ilustra um aparelho de polarografia.

 

 

 

 

Figura 9 – Aparelho de polarografia.

 

1.16.1 Aplicações da Polarografia

 

A polarografia de varredura linear foi usada para a determinação quantitativa de uma ampla variedade de espécies orgânicas e inorgânicas, inclusive moléculas de interesse bioquímico e biológico. Atualmente, os métodos de pulso suplantaram o método clássico quase completamente devido à maior sensibilidade, conveniência e seletividade. Geralmente, aplicações quantitativas estão baseadas em curvas de calibração nas quais as alturas dos máximos são lançadas em gráfico em função da concentração do analito. Em algumas situações, emprega-se o método de adição de padrão no lugar de curvas de calibração. Em ambos os casos, é essencial que a composição dos padrões seja o mais próxima possível da composição da amostra, com relação às concentrações de eletrólitos e pH. Quando isso é feito, podem ser atingidas precisões e exatidõe3s relativas no intervalo de 1 a 3%.

 

1.16.1.1 Aplicações Inorgânicas

 

O método polarográfico é amplamente aplicável na análise de substâncias inorgânicas. A maioria dos cátions metálicos, por exemplo, é reduzida no eletrodo gotejante. Mesmo os metais alcalinos e alcalino terrosos sofrem redução, desde que o eletrólito suporte não reaja nos altos potenciais necessários.

O método polarográfico também é aplicável n a análise de ânions inorgânicos, como bromato, iodato, dicromato, vanadato, seleneto e nitrito. Em geral, os polarogramas para essas substâncias são afetados pelo pH da solução porque o íon hidrogênio participa das suas reduções. Conseqüentemente, o pH deve ser fixado por tampões eficazes para que os dados sejam reprodutíveis.

 

1.16.1.2 Análise Polarográfica Orgânica

 

Praticamente desde o seu início, o método polarográfico tem sido usado para estudar e determinar compostos orgânicos com muitas publicações sendo dedicadas a este assunto. Vários grupos funcionais comuns são reduzidos no eletrodo gotejante, tornando possível a determinação de muitos compostos orgânicos. Entretanto, o número de grupos funcionais que podem ser oxidados em um eletrodo gotejante de mercúrio é relativamente limitado porque potenciais anódicos maiores do que +0,4 V (vs. SCE) não podem ser empregados devido à oxidação do mercúrio. Todavia, grupos funcionais orgânicos oxidáveis podem ser estudados voltametricamente em microeletrodos de platina, ouro ou carbono.

 

 

2. ELETROFORESE

A eletroforese é um método de separação baseado na diferença de velocidade de migração de espécies carregadas em uma solução-tampão através da qual tenha sido aplicado um campo elétrico de corrente contínua.

A eletroforese foi aplicada a vários problemas de separação analíticos difíceis: ânions e cátions inorgânicos, aminoácidos, catecolaminas, drogas, vitaminas, carboidratos, peptídeos, proteínas, ácidos nucléicos, nucleotídeos, polinucleotídeos e numerosas outras espécies.

 

 

2.1 FUNDAMENTOS

 

Uma característica particular da eletroforese é a sua habilidade única de separar macromoléculas carregadas de interesse da indústria biotecnológica e de pesquisas em biologia e bioquímica. Por muitos anos, a eletroforese é a sua habilidade única de separar macromoléculas carregadas de interesse da indústria biotecnológica e de pesquisas em biologia e bioquímica. Por muitos anos, a eletroforese foi um poderoso método de separação de proteínas (enzimas, hormônios, anticorpos) e de ácidos nucléicos (DNA, RNA) para a qual oferecia resolução sem igual. Por exemplo, para seqüenciar DNA, é necessário distinguir entre polinucleotídeos de cadeia longa com massa molecular variando de 200 a 500 e diferindo entre si por apenas um nucleotídeo. Apenas a eletroforese tem poder de resolução suficiente para lidar com este problema.

 

2.1.1 Tipos de Eletroforese

 

 As separações por eletroforese são feitas atualmente em dois formatos bastante diferentes: um é chamado eletroforese em placa e a outra eletroforese capilar. O primeiro é um método clássico que foi usado por muitos anos para separar espécies complexas, de alta massa molecular e de interesse bioquímico e biológico. As separações em placa são feitas sobre uma fina camada plana ou placa de gel poroso semi-sólido que contém uma solução-tampão aquosa nos seus poros. Essa placa geralmente tem dimensões de uns poucos centímetros de lado, como uma placa para cromatografia de camada delgada, e é capaz de separar várias amostras simultaneamente. As amostras são introduzidas como manchas ou faixas sobre a placa e um potencial de corrente contínua é aplicado através da placa por um certo tempo.

A eletroforese em placa é, atualmente, a ferramenta de separação mais usada por biólogos e bioquímicos. Monografias, livros-texto e revistas sobre ciências da vida usualmente contêm centenas de fotografias de placas de eletroforese. A eletroforese capilar, que é uma versão instrumental da eletroforese, foi desenvolvida e usada apenas a partir dos anos 1980 e tornou-se um importante método de separação usado por químicos e profissionais de ciências da vida. Em muitos casos, este novo método parece ser um substituto satisfatório da eletroforese em placa, com algumas vantagens importantes que serão descritas a seguir.

 

 

2.2 ELETROFORESE CAPILAR

 

Mesmo sendo tão útil quanto a eletroforese convencional em placa tem sido e continua a ser, este tipo de separação por eletroforese é tipicamente lenta, trabalhosa, difícil de ser automatizada e não produz informação quantitativa muito precisa. Durante meados e final dos anos 1980, houve um crescimento explosivo da pesquisa e da aplicação de eletroforese feita em tubos capilares e também do aparecimento de numerosos equipamentos comerciais. A eletroforese capilar (em inglês, CE – capillary electrophoresis) faz separações com alta resolução e alta velocidade, em volumes de amostra excepcionalmente pequenos (0,1 a 10nL, ao contrário da eletroforese em placa que requer amostras na faixa de µL). Adicionalmente, na saída do capilar, as espécies separadas são eluidas, de modo que detectores, como os de HPLC, podem ser usados, em vez da pouco eficiente técnica de manchas da eletroforese em placa.

 

2.2.1 Instrumentação para Eletroforese Capilar

 

Como mostrado na Figura 10, a instrumentação para eletroforese capilar é simples. Um capilar de sílica fundida preenchido com solução-tampão, tipicamente com 10 a 100 µm de diâmetro interno e 40 a 100 cm de comprimento, estende-se entre dois reservatórios de solução-tampão que também contêm dois eletrodos de platina. A introdução da amostra é feita em uma extremidade e a detecção na outra. A polaridade da alta tensão pode ser como está indicada ou invertida para permitir a separação de ânions.

 

Figura 10 – Esquema de um sistema para eletroforese capilar por zona.

 

Embora a instrumentação seja conceitualmente simples, há grandes dificuldades experimentais na introdução da amostra e na detecção, devido aos volumes muito pequenos envolvidos. Uma vez que o volume de um capilar normal é da ordem de 4 a 5µL, os volumes de injeção e detecção devem ser da ordem de alguns nanolitros ou menor.

2.3 APLICAÇÕES DE ELETROFORESE CAPILAR

 

Separações por eletroforese capilar são feitas de várias formas chamadas modos. Deve-se salientar que esses modos foram empregados primeiramente em eletroforese em placa e, depois, adaptados para separações por eletroforese capilar. Estes modos incluem eletroforese capilar por zona (CZE), eletroforese capilar em gel (CGE), focalização isoelétrica capilar (CIEF) e isotacoforese capilar (CITP). As seções que se seguem ilustram aplicações típicas de cada uma dessas técnicas.

 

2.3.1 Eletroforese Capilar por Zona (CZE)

 

Na eletroforese capilar por zona, a composição do tampão é constante na região da separação. O potencial aplicado faz com que os diferentes componentes iônicos da mistrua migrem de acordo com a sua própria mobilidade e se separem emm zonas que podem ser completamente resolvidas ou apresentar superposição parcial.

 

2.3.1.1 Separação de Íons Pequenos

Na maioria das separações de íons pequenos por eletroforese, verificou-se que, para diminuir o tempo, o melhor é deslocar os íons do analito na mesma direção, do fluxo eletroosmótico. Assim, em separações de cátions, as paredes do capilar não são tratadas e o fluxo eletroosmótico e o movimento dos cátions vão em direção ao cátodo. Em separação de ânions,  por outro lado, o fluxo eletroosmótico é usualmente invertido, tratando-se as paredes do capilar com um sal de alquilamônio, como brometo de cetil-trimetilamônio. Os íons de amônio positivamente carregados ligam-se à superfície carregada negativamente da sílica e, por sua vez, criam uma dupla camada de solução carregada negativamente, que é atraída para o ânodo, revertendo assim o fluxo eletroosmótico.

Várias razões importantes para a adoção de métodos de eletroforese foram identificadas: baixo custo dos equipamentos, menores tamanhos de amostras, velocidade muito maior e melhor resolução.

Os tamanhos de amostras para eletroforese estão no intervalo de nanolitros enquanto que amostras de microlitros ou maiores usualmente são necessárias em outros tipos de análise de íons pequenos. Assim, os métodos de eletroforese são mais sensíveis que os outros métodos baseados em massa (mas comumente não-baseados em concentração).

A Figura 11 ilustra a rapidez e a resolução insuperáveis das separações por eletroforese para ânions pequenos. Neste caso, 30 ânions foram separados em exatos 3 minutos. Tipicamente, uma separação por troca iônica de apenas três ou quatro ânions seria feita neste mesmo breve tempo. A Figura 30-11 ainda ilustra a velocidade na qual as separações podem ser feitas. Neste caso, 19 cátions foram separados em menos de dois minutos.

 

Figura 11 – Eletrograma mostrando a separação de 30 ânions. Diâmetro interno do capilar: 50micrômetros(sílica fundida). Detecção: UV indireta, 254 nm.

 

2.3.1.2 Separação de Espécies Moleculares

 

Muitos herbicidas, pesticidas e fármacos sintéticos pequenos que são iônicos ou cujos derivados podem ser iônicos, podem ser separados e analisados por CZE. Proteínas, aminoácidos e carboidratos são separados em tempos mínimos por CZE. No caso de carboidratos neutros, as separações são precedidas pela formação de complexos de borato carregados negativamente. Esses complexos são formados se um tampão de borato for usado como meio de separação.

 

2.3.2 Eletroforese Capilar em Gel (CGE)

 

A eletroforese capilar em gel é comumente realizada em uma matriz polimérica porosa de gel, cujos poros contêm uma mistura tamponada na qual a separação é feita. Nos primeiros estudos de eletroforese em placa(veja Figura 12), a finalidade primária do meio polimérico era reduzir a dispersão do analito por convecção e difusão e propiciar um meio que pudesse ser usado convenientemente para detecção e varredura.

 

 

Figura 12 – Aparelho de eletroforese capilar em gel(CGE).

 

Verificou-se depois que esse tipo de meio gera uma ação de peneira molecular que retarda a migração das espécies em diferentes graus, dependendo do tamanho do poro do polímero e do tamanho dos íons do analito. Esse tipo de ação de peneira é particularmente útil na separação de macromoléculas, como proteínas, fragmentos de DNA e oligonucleotídeos que têm substancialmente a mesma carga, mas diferem no tamanho. Atualmente, a maioria das separações por eletroforese em macroescala é feita em placa de gel. Algumas separações por eletroforese capilar de espécies que diferem em tamanho também são feitas em géis contidos em tubos capilares.

O tipo mais comum de gel usado em eletroforese é um polímetro de poliacrilamida formado pela polimerização de acrilamida (CH2═CH─CO─NH2) na presença de um agente de cruzamento. O tamanho de poro do polímetro depende da relação entre o monômero e o agente de cruzamento (agente de ligações cruzadas). Quanto maior a quantidade de agente de cruzamento, menor o tamanho do poro. Outros géis usados são: agarose, um polissacarídeo extraído de uma alga marinha, metilcelulose e polietileno-glicol.

 

2.3.3 Isotacoforese Capilar (CITP)

 

Em isotacoforese capilar, todas as bandas de analito migram na mesma velocidade. Daí o nome isso para igual e taco para velocidade. Em uma aplicação particular, tanto cátions como ânions podem ser separados, mas não ambos ao mesmo tempo. Em uma separação, a amostra é injetada entre duas soluções-tampão: a primeira contendo íons de maior mobilidade do que qualquer dos íons presentes no analito e a final com íons de mobilidade mais baixa do que a dos íons da amostra. Por exemplo, na separação de ânions os íons cloreto que se movem muito rapidamente devem estar contidos na primeira solução-tampão e os íons heptanoato que se movem lentamente devem estar no tampão final. Para uma separação de ânions, a primeira solução de eletrólito está conectada ao ânodo e a outra, final, ao cátodo.

Quando o potencial é aplicado em uma separação isotacoforética, os íons do analito migram como em eletroforese por zona, cada íon com sua velocidade única, dada pelo produto µeE.

 

2.3.4 Focalização Isoelétrica Capilar (CIEF)

 

A focalização isoelétrica capilar é usada para separar espécies anfipróticas, como aminoácidos e proteínas, que contêm um grupo carboxílico fraco e um grupo amina que é uma base fraca.

2.3.4.1 Propriedades de Compostos Anfipróticos

 

Um composto anfiprótico é uma espécie que, em solução, é capaz de doar e receber prótons.

 

 

2.4 ELETROCROMATOGRAFIA CAPILAR (CEC)

 

A eletrocromatografia capilar (em inglês, CEC – capillary electrochromatography) é um híbrido da eletroforese capilar com HPLC e oferece algumas das melhores características de cada uma das duas técnicas.

A eletrocromatografia capilar (CEC) parece oferecer várias vantagens sobre as técnicas que a originaram. Primeiro, assim como a HPLC, pode ser aplicada na separação de espécies não-carregadas. Segundo, como a eletroforese capilar, permite separações altamente eficientes de microvolumes de solução de amostra sem a necessidade de sistema de bombeamento a alta pressão. Na eletrocromatografia, uma fase móvel é transportada através de uma fase estacionária pelo bombeamento eletrosmótico do fluxo em vez de bombeamento mecânico, simplificando de modo significativo o sistema.

 

2.4.1 Eletrocromatografia em Coluna Empacotada

 

A eletrocromatografia baseada em colunas empacotadas é a menos amadurecida entre as várias técnicas de eletrosseparação. Neste método, um solvente polar é dirigido pelo fluxo eletrosmótico através de um capilar empacotado com uma fase estacionária do tipo HPLC em fase reversa. As separações dependem da distribuição das espécies do analito entre a fase móvel e a fase estacionária líquida mantida no empacotamento.

 

 

3. LIMITE DE DETECÇÃO

 

        A definição qualitativa mais aceita de limite de detecção é da concentração ou da massa mínima de analito que pode ser detectada em um nível conhecido confiável. Este limite depende da razão entre a magnitude do sinal do analítico e o tamanho das flutuações estatísticas no sinal do branco. Insto é, a menos que o sinal analítico seja maior do que branco por um fator múltiplo de k da variação no branco devido aos erros aleatórios, é impossível detectar o sinal analítico com certeza. Então, assim que o limite de detecção for atingido, o sinal do branco e de seu desvio-padrão. O sinal analítico mínimo distinguível é então tomado como a soma do sinal médio do branco mais um múltiplo de k do desvio-padrão do branco.

 

 

4. CALIBRAÇÃO DE MÉTODOS INSTRUMENTAIS

 

        Com duas exceções, todos os métodos analíticos requerem calibração, um processo que relaciona o sinal analítico medido com a concentração do analito. Os três tipos mais comuns de calibração incluem a preparação e o uso de uma curva de calibração, o método de adição de padrão e o método todo de padrão interno.

 

4.1 Curvas de Calibração

 

        Para o uso da técnica de curva de calibração, vários padrões que contêm concentrações do analito conhecidas exatamente são introduzidas no instrumento, e a resposta instrumental é registrada. Normalmente, essa resposta é corrigida para o valor obtido com o branco no instrumento. Idealmente, o branco contém todos os componentes da amostra original exceto o analito. Os dados resultantes são então colocados em um gráfico com a resposta do instrumento corrigida versus à concentração do analito, como mostra a Figura 13.

 

 

Figura 13 – Gráfico de calibração linear para método de adição de padrão. A concentração da solução desconhecida pode ser calculada a partir da inclinação m e o intercepto b.

 

Na Figura 13, é mostrada uma curva de calibração típica. Gráficos, tais como este, que são lineares em um intervalo de concentração significativo(a faixa dinâmica) geralmente são obtidos e almejados porque estão menos sujeitos a erros do que curvas não-lineares. Entretanto, de modo não raro são observados gráficos não-lineares que requerem um grande número de dados de calibração para estabelecer grande número de dados de calibração para estabelecer exatamente a relação entre a resposta do instrumento e a concentração. Usualmente, a equação é ajustada à curva de calibração pela técnica de mínimos quadrados de forma que as concentrações da amostra possam ser calculadas diretamente.

O sucesso do método da curva de calibração é muito dependente da exatidão com que são conhecidas as concentrações dos padrões e quão próxima a matriz dos padrões está da matriz das amostras a serem analisadas. Infelizmente, estabelecer esta similaridade de matriz entre amostras complexas e padrões geralmente é difícil ou impossível de ser feita, e os efeitos da matriz levam a erros de interferência. Para minimizar os efeitos da matriz, normalmente é necessário separar analito do interference antes de obter a resposta medida do instrumento.

 

 

 

4.2 Métodos de adição de Padrão

 

Os métodos de adição de padrão são particularmente úteis na análise de amostrar complexas, nas quais a probabilidade de efeitos de matriz é alta. Um método de adição de padrões pode ser implementado de diversas formas. Uma das mais comuns envolve a adição de um ou mais incrementos de uma solução-padrão a alíquota da amostra de mesmo volume. Esse processo é freqüentemente denominado de spiking. Deve ser observado que, quando a quantidade de amostra é limitada, as adições podem ser feitas por sucessivas introduções de incrementos do padrão a um único volume medido da amostra. As medidas são realizadas com a amostra original e depois com a amostra mais o padrão, após cada adição. Na maioria das versões do método de adição de padrão, a matriz da amostra permanece quase inalterada após cada adição, a única diferença é a concentração do analito ou, em casos que envolvem a adição de um excesso de um reagente analítico, a concentração do reagente. Todos os outros constituintes da mistura reacional deveriam ser idênticos porque os padrões preparados em alíquotas da amostra.

 

4.3 Método de Padrão Interno

        Um padrão interno é uma substancia que é adicionada em quantidade constante a todas as amostras, aos brancos e os padrões de calibração em uma análise. Alternativamente, pode ser um componente principal das amostras e padrões que está presente em uma quantidade suficientemente grande de modo geral que sua concentração pode ser considerada constante para todos os casos. A calibração envolve, então colocar em m gráfico a razão entre o sinal do analito e o sinal do padrão interno em função da concentração do analito para obter as concentrações de analito a partir da curva de calibração.

 Uma grande dificuldade da aplicação do método do padrão interno é a de encontrar uma substancia adequada para servir como padrão interno e introduzir essa substancia tanto na amostra como nos padrões de modo reprodutível. O padrão do analito em vários aspectos, mas suficientemente diferente para ser facilmente distinguível pelo instrumento. O padrão interno deve estar ausente da matriz da amostra de forma que a única fonte de padrão seja a quantidade adicionada. Por exemplo, o lítio é um bom interno para a determinação de sódio ou potássio em soro sanguíneo porque o comportamento químico do lítio é similar a ambos os analitos, mas não ocorre naturalmente no sangue.

 Como exemplo, o método do padrão interno é freqüentemente usado na determinação de traços de elementos em metais por espectroscopia de emissão. Assim, em determinações de partes por milhão de antimônio e estanho em chumbo para ser usado por fabricantes de baterias, a intensidade relativa de uma linha forte de cada um dos componentes minoritários pode ser comparada cm a intensidade de uma linha fraca para o chumbo.

 Para que tal procedimento seja bem-sucedido, muito tempo e esforço são necessários na preparação de um conjunto de amostras de chumbo puro que contenham concentrações de antimônio e estanho exatamente conhecidas.

 

 

 

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

 

SKOOG, D.A. et. al. Princípios de análise instrumental. 5 ed. Porto Alegre: Bookman, 2002. p. 27-31, p. 567-595, p. 687-702.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

                              UNIVERSIDADE PARANAENSE – UNIPAR

                                                 RECONHECIDA PELA PORTARIA – MEC N° 1580, DE 09/11/93 – DOU 10/11/93.

                                            MANTENEDORA ASSOCIAÇÃO PARANAENSE DE ENSINO E CULTURA – APEC

 

 

 

 

Introdução, Fundamentação e Aplicação de Métodos Analíticos:

 

 

1. Voltametria;

2. Eletroforese;

3. Conceitos de Limites de Detecção; e

4. Calibração de Métodos Instrumentais.

 

 

 

 

 

 

 

 

Curso: Química – 4° Ano.

Disciplina: Análise Instrumental.

 

Acadêmicas:  José Luiz Banhara Júnior      RA: 33875.

Regiane da Silva Gomes      RA: 33890.

Alaine de Moura Lino            RA: 34229.

                     

Professor: José Gaspar Ferrarezi.

 

 

 

 

NOVEMBRO - 2007

 

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