1-Introdução

São compostos orgânicos de alto peso molecular, são formadas pelo encadeamento de aminoácidos. Representam cerca do 50% a 80% do peso seco da célula sendo, portanto, o composto orgânico mais abundante de matéria viva.  Pode-se dizer que as proteínas são polímeros de aminoácidos o que em suas moléculas existem ligações peptídicas em número igual no número de aminoácidos presentes menos um. Pode-se dizer, também, que os aminoácidos são monômeros dos peptídeos e das proteínas. Polímeros são macromoléculas formadas pela união de várias moléculas menores denominadas monômeros. Uma molécula protéica contém desde algumas dezenas até mais de 1.000 aminoácidos. 0 peso molecular vai de 10.000 a 2.800.000. A molécula de hemoglobina, por exemplo, é formada por 574 aminoácidos e tem peso molecular de 68.000. Justifica-se, assim, o fato de as moléculas protéicas estarem incluídas entre as macromoléculas. Podem-se classificar as proteínas em três grupos. Proteínas simples São também denominadas de homoproteínas e são constituídas, exclusivamente por aminoácidos. Em outras palavras, fornecem exclusivamente uma mistura de aminoácidos por hidrólise. Pode-se mencionar como exemplo: As Albuminas São as de menor peso molecular  São encontradas nos animais e vegetais. São solúveis na água. Exemplos: albumina do plasma sangüíneo e da clara do ovo. As Globulinas Possuem um peso molecular um pouco mais elevado, são encontradas nos animais e vegetais, São solúveis em água salgada. Exemplos: anticorpos e fibrinogênio. As Escleroproteínas ou proteínas fibrosas. Possuem peso molecular muito elevado. São exclusivas dos animais. São insolúveis na maioria dos solventes orgânicos. Exemplos: colágeno, elastina e queratina. A desnaturação é um processo, geralmente irreversível, que consiste na quebra das estruturas secundária e terciária de uma proteína. As proteínas são as moléculas orgânicas mais abundantes e importantes nas células e perfazem 50% ou mais de seu peso seco. São encontradas em todas as partes de todas as células, uma vez que são fundamentais sob todos os aspectos da estrutura e função celulares. Existem muitas espécies diferentes de proteínas, cada especializada para uma função biológica diversa. Além disso, a maior parte da informação genética é expressa pelas proteínas. A composição Todas contém carbono, hidrogênio, nitrogênio e oxigênio, e quase todas contêm enxofre. Algumas proteínas contêm elementos adicionais, particularmente fósforo, ferro, zinco e cobre. Seu peso molecular é extremamente elevado. Todas as proteínas, independentemente de sua função ou espécie

de origem, são construídas a partir de um conjunto básico de vinte aminoácidos, arranjados em várias seqüências específicas. A estrutura das proteínasa seqüência dos aminoácidos em uma proteína representa a estrutura primária, responsável pelas propriedades da molécula. Em decorrência à existência de pontes de hidrogênio entre o hidrogênio (carga positiva +) de um aminoácido com o oxigênio ou nitrogênio (carga negativa -) de um outro aminoácido não adjacente, é proporcionada uma torção na cadeia filamentosa, assumindo a proteína uma forma de helicoidal. Uma proteína não apresenta necessariamente aspecto linear helicoidal. As propriedades químicas dos aminoácidos podem ter efeitos de atração ou repulsão uns para com os outros, principalmente pelo estabelecimento de pontes bissulfeto (ligação envolvendo dois átomos de enxofre de aminoácidos cisteina), causando flexões (dobras) sobre si mesma, chamada de estrutura terciária. O agrupamento de duas ou mais estruturas terciárias combinadas a outras substâncias, vitaminas ou minerais: ferro, magnésio, iodo, forma a estrutura quaternária. Configuração espacial observada na molécula de hemoglobina, proteína conjugada a íon ferro, compondo os glóbulos vermelhos (hemácias ou eritrócitos do sangue), permitindo o transporte de oxigênio.

2- Objetivos:

2.1 - Objetivo geral:

Obter informações necessárias para a identificação da proteína, através dos métodos utilizados e assim encontrar o tipo de método mais eficaz para a realização desse processo.

2.2 - Objetivo específico:

Verificar os fundamentos técnicos para o processo de identificação da proteína através dos métodos trabalhados na reação de Biureto e Ninhidrina.

3-Matérias e Métodos

3.1-Identificação pela ninhidrina

  • Pipeta de volume fixo

  • Solução de aminoácido (Aspargina)

  • Solução de proteína (Ovoalbumina)

  • Tubos de ensaio

Ao adicionar 1 ml de proteína e 1 ml de aspargina respectivamente em 2 tubos de ensaio, em seguida adicionar 2 ml da solução de ninhidrina e levar para banho em ebulição.

3.2-Identificação pela reação do Biureto

  • Pipeta de volume fixo

  • Tubos de ensaio

  • Solução de proteína (Ovoalbumina)

  • Solução de aminoácido (Aspargina)

  • Solução de NaOH 2,5M

  • Solução de CuSo

Ao adicionar 1 ml de proteína no tubo e em outro tubo 1ml de aminoácido, em seguida adicionar 05 gotas de NaOH e 03 gotas de CuSo em ambos os tubos.

3.3-Desnaturação proteica

  • Pipeta de volume fixo

  • Pipeta

  • Tubos de ensaio

  • Etanol

  • Solução de acido tricloroacético

  • Solução de acetato de chumbo

  • Solução de proteína (Ovoalbumina)

  • Banho-Ebulição

Foi adicionado 1 ml da solução de proteína no 1º tubos de ensaio e em seguida foi levado para banho-ebulição para ter a desnaturação por calor.

No 2º tubo foi adicionado 1 ml da solução de proteína mais 1 ml da Solução de acido tricloroacético para ter a desnaturação por abaixamento de PH.

No 3º tubo foi adicionado 1 ml da solução de proteína mais 1 ml de etanol para ter a desnaturação por solvente orgânico.

No 4º tubo foi adicionado 1 ml da solução de proteína mais 1 ml da solução de acetato de chumbo para ter a desnaturação por metal pesado.

4-Resultados

4.1-Identificação por ninhidrina

Ao fazer a adição de ninhidrina nos tubos, eles apresentaram uma coloração amarelada, mas após aquecer por cinco minutos ambos ficaram positivos e apresentaram uma coloração roxa, sendo que a aspargina ficou mais concentrada que a ovoalbumina.

Para a identificação com ninhidrina é necessário ter duas extremidades amino e carboxi terminais livres e em todos os aminoácidos encontramos uma extremidade carboxi e uma extremidade amino livre. A ninhidrina é um agente oxidante forte, então vai promover a desaminação oxidativa, removendo o agrupamento amina. A ninhidrina serve para a identificação tanto de aminoácidos como de proteínas, mas sendo mais específico na identificação dos aminoácidos.

4.2-Identificação do Biureto

No tubo que continha a proteína, observou-se que antes da adição do sulfato de cobre era incolor, agora apresenta coloração púrpura. Já no tubo onde continha aminoácido, que também no início era incolor, com a adição do sulfato ficou com uma coloração azulada.

O que podemos observar foi que no tubo que continha proteína obteve o resultado POSITIVO para a identificação com biureto, mostrando que esse método é mais seguro e eficaz para a identificação de proteína, pois no meio alcalino com a presença do cobre há uma formação do complexo abaixo que dá a coloração púrpura. Para que dê o resultado positivo é necessário que haja dois tripeptideos e duas ligações peptídicas.

4.3-Desnaturação proteica

1º Ação do Calor:

A temperatura é um fator importante na solubilização das proteínas. Em geral, entre O e 40°C o aumento da temperatura favorece a solubilidade. Isto decorre do fato do calor provocar um aumento da energia cinética das moléculas de proteína, facilitando a interação destas com o solvente. Entretanto, acima de 40°C, as proteínas começam a precipitar: os movimentos moleculares se tornam tão intensos que os grupamentos químicos se afastam além da distância permitida para se reassociarem, aproximando-se de outros com os quais se associam. Assim, ocorre o rompimento das estruturas secundária, terciária e quaternária e a proteína adquire outra conformação, uma conformação inativa (desnaturada).

2º Precipitação por ácidos fortes (Abaixamento de PH)

A solubilidade de uma molécula depende da interação entre os grupos polares dos radicais –R e as moléculas de água através de pontes de hidrogênio. Grandes variações de pH modificam a ionização destes grupos e, portanto, a interação da proteína com o meio. Nos seres vivos, as proteínas estão em contínua modificação de sua conformação, uma vez que as concentrações locais de íons, o pH e o poder redutor sofrem pequenas variações, alterando a interação dos vários grupos reativos das proteínas entre si e com o meio. Valores extremos de pH afetam bruscamente estas interações, causando uma mudança radical na conformação da proteína para um estado conformacional biologicamente inativo. Quando uma proteína é modificada em sua conformação, de tal modo que perde sua função biológica, ela é dita desnaturada. A desnaturação é um fenômeno que não envolve clivagem da estrutura primária da proteína (ruptura das ligações peptídicas), mas sim, um rompimento das estruturas secundária, terciária e quaternária. A desnaturação é um re-arranjo da conformação protéica numa maneira não natural e de escassa ou nula função biológica. Esse fenômeno pode ser acompanhado através de modificações das propriedades físico-químicas da proteína, como a solubilidade: uma proteína desnaturada é insolúvel em água e precipita em solução.

3º Solventes orgânicos

A ação desses solventes vai depender da sua maior ou menor polaridade e, portanto, da sua capacidade de interagir com certos grupos laterais das proteínas através de pontes de hidrogênio ou promovendo ruptura de ligações hidrofóbicas. Os detergentes são substâncias orgânicas que apresentam grupos hidrofóbicos (apolares) e grupos hidrofílicos (polares). As cadeias laterais hidrofóbicas das proteínas podem estabelecer fortes interações com a parte hidrofóbica da molécula de detergente enquanto que a parte polar da molécula estabeleceria forte interação com o solvente e com os grupos polares da proteína. Assim devido aos dois tipos de forças presentes, a estrutura protéica tenderia a ser abrir e desordenar.        

4º Precipitação por sais de metais pesados

Os sais de metais pesados (Hg2+, Pb2+, Cu2+, Fe2+, Cd2+ e Zn2+) causam a desnaturação de proteínas, isto é, modificam a sua conformação natural com a atividade biológica (conformação nativa) para uma conformação não natural biologicamente inativa (desnaturada). As moléculas protéicas desnaturadas precipitam. Os sais de metais pesados, portanto, precipitam as proteínas por desnaturação.

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