determinaçao de proteinas plasmaticas por eletroforese

determinaçao de proteinas plasmaticas por eletroforese

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Eletroforese em Agarose Geral

Compilado pelo Controle de Qualidade Bioquímica Outubro de 9

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CELMGEL Filme de Agarose Geral

Proteinograma Lipidograma

Alb. a1a2 b g
(b1+b2)

a Pré-b b

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PROTEINOGRAMA 4

Fracionamento de proteínas4

Zona Pré-Albumina6 Zona Albumina6 Interzona Albumina-Alfa-1 6 Zona Alfa-1-Globulina 6 Zona Alfa-2-Globulina 7 Zona Beta-Globulina 7 Zona Gama8

Interpretação do Traçado Eletroforético9

Processo inflamatório: 10

Agudo 10 Crônico 10

Hepatites e Cirrose hepática:1 Perdas Protéicas:1 Síndrome Nefrótica: 12

Alterações das globulinas12 Hipogamaglobulinemias 12

Gamopatias monoclonais 13 Gamopatias policlonais 13

LIPIDOGRAMA 14 Introdução 14 Hiperlipoproteínemias hereditárias 16 Eletroforese de lipoproteínas19

REFERÊNCIAS 24

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Fracionamento de proteínas

A análise de quadro protéico-plasmático é de particular interesse em bioquímica clinica, devido aos importantes progressos acumulados nos últimos anos sobre as características físico-químicas e estruturais das proteínas humanas. Somam-se a esses aspectos as propriedades fisiológicas e o significado clínico de numerosas proteínas plasmáticas que, devido à continua evolução metodológica de suas qualificações e quantificações, têm permitido auxiliar no diagnóstico de várias alterações patológicas que refletem no conteúdo das proteínas plasmáticas. Entre os métodos de qualificação e quantificação dessas proteínas destaca-se a eletroforese, que se tem tornado um importante meio auxiliar de diagnóstico na maioria dos laboratórios clínicos. A eletroforese permite uma avaliação aproximada das concentrações de várias proteínas importantes, cujas alterações estruturais, seja de regulação de suas sínteses, ou de seu maior consumo, podem refletir nas suas mobilidades eletroforéticas ou nas suas concentrações.

Entre os meios disponíveis para o fracionamento das proteínas nos laboratórios clínicos, podemos citar as eletroforeses em acetato de celulose e em agarose. Os meios que incluem eletroforese em papel de gel de amido não são mais empregados na rotina laboratorial, devido à pouca sensibilidade analítica do papel, ou à dificuldade da preparação do gel, além do excessivo tempo de corrida. As eletroforeses em gel de poliacrilamida e as de altas resoluções ainda apresentam muitas dificuldades na interpretação de leitura de suas inúmeras frações. Dessa forma, consideramos apenas os dois primeiros meios.

A eletroforese em agarose produz melhor resultado no processo de fracionamento que o acetato de celulose. Ambos os meios permitem que proteínas com peso molecular acima de 106 daltons se movam livremente de acordo com sua carga. Convencionalmente, a eletroforese de proteínas dos fluídos biológicos é realizada entre pH 8,5 e 9,5 que, com exceção das imunoglobulinas, migram para o ânodo (pólo positivo). A mobilidade catódica das gama-globulinas se deve a um fluxo do tampão, na direção do ânodo para o cátodo (pólo negativo), que ocorre no próprio suporte de separação. Este fenômeno denominado eletroendosmose, depende sobretudo da carga fixada pelo suporte e da composição iônica do tampão.

O desenvolvimento tecnológico dos meios de suporte em agarose e acetato de celulose tem permitido a elaboração de materiais com alta sensibilidade de fracionamento, que podem ser agrupados em três níveis de qualidade técnica, classificados de 1 a 3. O nível 1 é a tradicional separação “microzonal”, adequado a determinação quantitativa por densitometria das cinco zonas classificadas por albumina, alfa 1, alfa 2, beta e gama-globulina (Fig. 1). O nível 2 é dotado de uma maior capacidade resolutiva devido a uma melhor exploração densitométrica que, por meio da projeção televisiva de imagens bidimensionais, permite evidenciar diversas proteínas que fazem parte das cinco zonas eletroforéticas. O nível 3, por fim, é obtido por tecnologia altamente desenvolvida para uma peculiar propriedade resolutiva de determinado tipo de acetato de celulose, o sistema Hi-Phore, elaborado pela Gelman Sciences. Esse sistema possibilita a identificação de doze proteínas plasmáticas: pré-albumina, albumina, alfa-lipoproteína, alfa-1-antitripsina, alfa-1-antiquimiotripsina, alfa-2-macroglobulina, haptoglobina, globulina insolúvel, transferrina, complemento C-3, fibrinogênio e imunoglobulina (Fig. 2). O nível 3, entretanto, é usado exclusivamente nas interpretações qualitativa e semiquantitativa conjuntamente, e deve ser associado aos métodos específicos de imunoquímica para as dosagens quantitativas.

Todos esses três procedimentos descritos representam muito bem o momento de transição tecnológica da atualidade e oferecem condições técnicas adequadas às diferentes interpretações fisiopatológicas conforme a exigência de cada centro médico.

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Figura 1 - Fracionamento eletroforético das proteínas séricas em gel de agarose, tampão tris-glicina pH 9,5. Separação das frações de albumina, alfa-1, alfa-2, beta e gama, do pólo positivo para o negativo. Notar a divisão da fração beta em duas subfrações distintas.

Figura 2 - Representação esquemática da separação de proteínas plasmáticas por sistema Hi-Phore (Gelman Sciences). Fracionamento em doze bandas.

Cerca de 100 tipos diferentes de proteínas plasmáticas foram identificadas até o presente utilizando-se técnicas sofisticadas e de alta sensibilidade. Entretanto, somente 10 a 12 tipos podem ser detectados pelas técnicas dos níveis 2 e 3, constituindo mais de 90% do conteúdo protéico do plasma - e por isso denominadas componentes determinantes das zonas do traçado eletroforético. Se empregarmos procedimentos de separação suficientemente resolutiva, estes componentes são evidenciáveis de tal forma que permitem o seu reagrupamento nas cinco ou seis zonas de traçado clássico. O aspecto mais importante da evolução desse estudo, acumulado nestes últimos anos, constituem em arranjar nomes, em termos reais, dos componentes protéicos identificados por meio da separação microzonal. Todavia, não conhecendo os seus componentes, as zonas foram identificadas por símbolos: alfa-1, alfa-2, beta e gama-globulinas; que, de certa forma, refletiam os significados fisiológicos e fisiopatológicos relacionados com as alterações qualitativa e quantitativa das frações protéicas separadas eletroforeticamente. Assim, ficou por conta do progresso tecnológico e dos conhecimentos científicos a identificação da maioria dos componentes plasmáticos agrupados nestas cinco zonas. Atualmente as eletroforeses de nível 1, em meio de agarose e acetato de celulose, podem identificar de 7 a 8 zonas de componentes protéicos plasmáticos extraídas do soro, desde que as mesmas sejam realizadas com rigor técnico, drogas de boa proveniência, agarose e acetato de celulose de boa qualidade e aparelhos de boa sensibilidade. Esses componentes são identificados nominalmente em sete zonas: pré-albumina, albumina, interzona albumina-alfa-1, alfa-1-globulina, alfa-2-globulina, beta-globulina e gama-globulina.

Pólopositivo Pólo negativo

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Zona Pré-Albumina

Esta zona se caracteriza por uma banda fraca e espalhada, com velocidade migratória maior que a albumina e é constituída de uma única proteína denominada pré-albumina. Sua concentração normal é de 20- 45 mg/dl e sua função é o transporte do hormônio tireóideo. O significado clínico dessa proteína não está correlacionado com a propriedade fisiológica: a sua diminuição se observa nos processos inflamatórios agudos de etiologia diversa, porém, mais interessante é a diminuição precoce e marcante que se associa à insuficiência funcional das células hepáticas. Assim, a pré-albumina é um indicador hepato-celular de mais utilidade que a albumina, cujas modificações são constantes e tardias. A diminuição da pré-albumina é facilmente evidenciável no traçado eletroforético pois se traduz no desaparecimento da fração correspondente, mesmo que esta diminuição seja de intensidade moderada, uma vez que em condição normal sua concentração já é baixa.

Zona Albumina

Corresponde à proteína do mesmo nome. De fato, a característica físico-química, a propriedade fisiológica e o significado clinico desta proteína são conhecidos há muito tempo. A concentração normal é 3,2 a 5,0 g/dl. As principais funções são: a atividade osmótica plasmática e a função de transporte específico do material resultante de várias substâncias endógenas e exógenas, bilirrubina, ácidos graxos, cálcio, corantes e fármacos. A união com algumas destas substâncias (bilirrubina, fármacos) modifica a carga elétrica da albumina, e isto se evidencia no traçado eletroforético por meio de um alongamento da fração em direção anódica (albumina rápida): este fenômeno, em condições de sobrecarga da função de transporte, pode causar o desdobramento da fração de albumina. Além desta alteração de migração, a análise quantitativa desta proteína tem importante significado clínico pois a sua diminuição pode estar relacionada a um defeito de sua síntese hepática (nas hepatopatias graves crônicas), ou a perdas renal (na síndrome nefrótica), intestinal (enteropatias protideodispersivas) e cutânea (queimaduras extensas). Também se observa a diminuição de albumina nos processos inflamatórios agudos, por aumento da permeabilidade capilar e em situações de subnutrição, má absorção e caquexia neoplásica. Apesar de vários fatores terem influência no metabolismo da albumina, a hipoalbuminemia é freqüentemente uma evidência tardia, especialmente nas hepatopatias. Devido à considerável intensidade da coloração da fração correspondente, a hipoalbuminemia é evidenciável no traçado eletroforético somente quando o grau de diminuição é marcante e sua concentração próxima de 2,5 g/dl.

Interzona Albumina-Alfa-1

O espaço que separa a fração de albumina daquela da alfa-1-globulina não revela, em condições normais, a presença de alguma proteína, aparecendo um espaço totalmente claro. Na realidade migram nesta zona duas proteínas de importância clínica: a alfa-feto-proteína e a alfa-lipoproteína. Ambas não são visíveis em condições fisiológicas normais: a primeira, devido à sua concentração muito baixa; e a segunda, pela baixa afinidade aos corantes de proteínas utilizados correntemente. Estas proteínas quando analisadas por técnicas de nível 3, podem ser evidenciadas em determinadas condições patológicas; por exemplo: a alfa-lipoproteína está aumentada no alcoolismo crônico, na subnutrição ou nas hepatopatias graves. É importante recordar que a alfa-feto proteína está elevada fisiologicamente no soro de recém-nascidos.

Zona Alfa-1-Globulina

Apesar de outras proteínas migrarem nesta zona, em prática a alfa-1-antitripsina (limite normal 85-200 mg/dl) é a única proteína responsável pela coloração da alfa-1-globulina. Esta proteína é o componente mais importante entre os “inibidores de proteases”, termo que compreende um grupo de proteínas que têm a função de neutralizar as atividades das enzimas proteolíticas, seja de natureza bacteriana ou leucocitária, durante um processo inflamatório agudo. Desta forma, sua síntese é estimulada durante a resposta inflamatória aguda. O aumento da alfa-1-antitripsina é particularmente característico das hepatopatias crônicas e agudas em fases não muito avançadas, no entanto tende à diminuição nas fases terminais da cirrose; o aumento todavia se observa nos casos de hiperestrogenismo. Por outro lado, a deficiência hereditária da alfa-1-antitripsina, que se traduz pela ausência da zona alfa-1 na eletroforese, é devido a uma variante genética caracterizada por uma concentração plasmática muito baixa na forma de homozigose: esta alteração hereditária causa graves lesões fibrosantes do tecido pulmonar (enfisema na fase de adolescência e em adultos jovens), ou cirrose hepática na infância. A forma heterozigota da deficiência hereditária de alfa-1-antitripsina se revela eletroforeticamente pelo desdobramento da fração alfa-1-globulina. Da mesma forma, como ocorre em outras alterações das proteínas plasmáticas, a eletroforese é o único meio que permite evidenciar a deficiência hereditária da alfa-1- antitripsina, que não se associa a nenhuma sintomatologia (na forma heterozigota) mas é importante sob o ponto de vista preventivo. É necessário salientar que o desdobramento da fração alfa-1 é verificado na análise visual do traçado eletroforético, uma vez que a análise por densitometria nem sempre detecta esta alteração.

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Como foi dito no início, a zona alfa-1-globulina compreende outras proteínas alem da alfa-1-antitripsina das quais é de particular interesse clínico a alfa-1-glicoproteína ácida. Essa proteína é o principal componente da “mucoproteína” de Winzler, e o aumento de sua concentração (40-90 mg/dl em indivíduos normais) não contribui para elevar o nível quantitativo da zona alfa-1. Este fator decorre da fraca fixação do corante devido ao elevado conteúdo de carboidrato na sua estrutura. Esta proteína não é um inibidor das proteases, mas aumenta consideravelmente nos processos inflamatórios agudos.

Um outro inibidor das proteases que também faz parte da zona alfa-1-globulina é a alfa-1- antiquimiotripsina. Esta proteína de baixa concentração em condições normais, mas que aumenta visivelmente e com muita rapidez na fase inflamatória aguda, é facilmente identificada por técnicas do nível 3.

Zona Alfa-2-Globulina

Essa zona é determinada por duas proteínas: a alfa-2-macroglobulina - com mobilidade maior - e a haptoglobina. Esta última proteína pode variar de posição na mobilidade eletroforética por causa de sua heterogeneidade molecular. Assim, a estrutura da haptoglobina depende de duas cadeias peptídicas de diferentes dimensões e, por isso, pode dar origem a três combinações fenotípicas diferentes: o tipo 1-1, de menor dimensão molecular, possui maior velocidade de migração sobrepondo-se, inclusive, à banda da alfa-2- macroglobulina; o tipo 2-1, de dimensão intermediária, aparece no traçado como uma banda larga e dispersa que cobre toda a área alfa-2; e o tipo 2-2, quando presente, separa-se nitidamente da alfa-2-macroglobulina.

A alfa-2-macroglobulina, apesar de fazer parte dos “inibidores de proteases”, apresenta pouco interesse clínico nos dias atuais. A sua concentração (100 a 250 mg/dl no adulto normal) está mais elevada nos períodos infantil e senil. Seu aumento fisiológico ocorre por retenção seletiva e na síndrome nefrótica. A sua diminuição pode ser observada nas hepatopatias crônicas de fase avançada - pois sua síntese ocorre no fígado, e algumas vezes nas condições de fibrinólise por hiperconsumo.

Mais interessante sob o ponto de vista clínico é a haptoglobina (limite normal de 40 a 170 mg/dl) uma vez que suas funções são bem conhecidas: a haptoglobina forma um complexo protéico com a hemoglobina livre plasmática que é removido, posteriormente, por fagocitose realizada por células retículo-endoteliais. Nas síndromes hemolíticas ocorre marcante diminuição das haptoglobinas podendo, por isso, ser utilizada como um sensível índice de hemólise. O interesse clínico das haptoglobinas não se resume as descrições acima, uma vez que esta proteína é um dos “fatores da fase aguda”, aumentando consideravelmente no curso dos processos inflamatórios agudos.

Zona Beta-Globulina

Duas proteínas compõem esta zona no traçado eletroforético com acetato de celulose: a transferrina e o componente C-3 do sistema de complemento. A adição de cálcio à solução tampão causa nítida separação dessas duas proteínas. A transferrina (150-350 mg/dl) é sintetizada nas células hepáticas e sua função é o transporte do ferro plasmático: o seu aumento é a expressão de um estado de carência de ferro. É importante destacar que a síntese de transferrina, embora sensível à ação dos hormônios estrogênicos, não apresenta aumento fisiológico na gravidez e no tratamento anticonceptivo. A diminuição de transferrina se observa nas hepatopatias crônicas.

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