Trabalho final

Trabalho final

(Parte 1 de 3)

Universidade de São Paulo

Faculdade de Ciências Farmacêuticas

Tecnologia Bioquímico-Farmacêutica

FBT0505 - Enzimologia Industrial I

Enzimas Digestivas

  1. Introdução

Em todas as células vives ocorrem ininterruptamente reações que, devido à sua grande complexidade, deveriam ser muito lentas nas temperaturas em que essas reações se processam (ao redor de 37ºC). No entanto, essas reações são muito rápidas, o que nos leva à conclusão de que existem nas células vivas substâncias catalisadoras que diferem dos catalisadores inorgânicos pelo fato de serem substâncias muito mais complexas, formadas no interior das células vivas, mas capazes de agir também fora das células. São fatores importantes na tecnologia de alimentos pelo papel que desempenham no seu processamento e deterioração.

As enzimas são substâncias sólidas, mas difíceis de serem cristalizadas devido à complexidade de suas estruturas químicas. Com algumas exceções, são solúveis em água e álcool diluído, e quando em solução sofrem precipitação pela adição de sulfato de amônio, álcool ou ácido tricloroacético. São inativadas pelo calor e esta, talvez, seja a propriedade mais importante desses compostos em relação à tecnologia de alimentos.

Quimicamente as enzimas são proteínas com uma estrutura química especial, contendo um centro ativo, denominado apoenzima e algumas vezes um grupo não protéico, denominado coenzima. À molécula toda (apoenzima e coenzima) é dado o nome de haloenzima. Dependendo de tipo de ligação, o grupo prostético pode ser separado da proteína por métodos brandos, como por exemplo, diálise.

Grande parte das proteínas sintetizadas na célula são enzimas, referidas como enzimas intracelulares, citoplasmáticas. Somente podem ser obtidas e avaliadas por rompimento da célula. Mas, esta também tem a capacidade de sintetizar enzimas que são excretadas para fora da célula, podendo ser encontradas no meio de cultivo ou de propagação celular, lá sendo mais facilmente isoladas e avaliadas. São as enzimas extracelulares. Acredita-se que estas são sintetizadas nos ribossomos ligados à membrana celular, de lá passando para fora sob forma linear, assumindo sua conformação própria e característica, fora da célula.

Quase todas as enzimas preparadas em escala industrial até hoje são extracelulares, porque seu isolamento dos meios ou caldos de cultivo é geralmente mais simples, embora elas se encontrem sob forma muito diluída nestes meios, o que pode tornar o seu isolamento muito dispendioso. Porém a maior parte das enzimas é intracelular, porque lá são continuamente sintetizadas metabolicamente.

Como o mecanismo celular dos sistemas vivos de animais, vegetais e microrganismos depende das enzimas, a fonte primária destas são tecidos animais (glândulas, principalmente), tecidos vegetais (sementes, frutas, exsudações) e culturas de microrganismos, quer fazendo-se uso de cultivo total, quer extraindo as enzimas do meio de cultura de bactérias, fungos e leveduras.

Não é de se admirar, portanto, que a maior parte das enzimas produzidas industrialmente tenha aplicação na produção, conservação e modificação de produtos animais e vegetais (principalmente alimentos), na produção de medicamentos (vitaminas, hormônios) e na produção de derivados de matérias primas animais e vegetais. Em todos casos de aplicação citados, se trata, fundamentalmente, de imitar tecnologicamente o que é feito na natureza, embora em escala condicionada à necessidade e vontade do homem.

Como fonte de enzimas, os vegetais têm sua limitação no fato de que relativamente pouca enzima pode ser extraída de uma em geral grande massa vegetal; o que somente é econômico onde mio de obra e terra tem custo menor. São poucas as enzimas que podem ser obtidas economicamente nestas condições. Entre elas, as proteinases, papaína, bromelina e ficina.

A papaína é obtida do mamoneiro (Cerca papsya), a partir do líquido leitoso do fruto verde, ou do caule e das folhes. A bromelina é obtida dos caules deixados nos pés do abacaxi ou do ananás comum, após a colheita do fruto, embora folhas e o próprio fruto também a contenham, mas em menor quantidade. A ficina é contida no látex, esxudado que resulta de incisões feitas nas cascas de figueiras tropicais como Fícus glabrata, Fícus caica e outras espécies. Também a partir da agave, produtora de sizal, é possível obter proteinase.

As enzimas proteolíticas sozinhas respondem por aproximadamente 60% das enzimas comercializadas, incluindo proteases microbianas.

Também uma enzima oxidativa é produzida a partir de vegetais, a lipoxidase, uma oxigenase, extraída da farinha de soja.

Por outro lado, o malte, o qual pode ser considerado como enzima amilolítica bruta, é, seguramente a "enzima” vegetal mais difundida.

Enzimas de glândulas e órgãos animais também tem produção limitada, porque são obtidas de subprodutos da industrialização de carnes, recurso alimentar nobre e, por isso, além de dispendiosos, de oferta geralmente escassa. Um exemplo é o pâncreas bovino que, simplesmente congelado e moído, pode atuar como protease na chamada "purga” de peles.

Enzimas microbianas, produzidas através do cultivo dirigido de microrganismos em substratos apropriados, não sofrem as limitações apontadas. Havendo disponibilidade dos insumos do substrato ou meio de cultura, sendo disponíveis e conhecidos o agente microbiano mais apropriado e o método e condução do cultivo, a produção é potencialmente ilimitada, dependendo da economia do respectivo processo.

Na tabela abaixo são indicados os principais usos de importantes enzimas produzidas em escala industrial.

As enzimas digestivas, objeto de estudo deste trabalho, atuam sobre as proteínas naturais, degradando-as em peptídeos e aminoácidos.

A digestão adequada dos alimentos é primordial para a boa saúde do indivíduo e uma digestão incompleta ou desordenada pode ser a principal causa do desenvolvimento de muitas doenças. Alimentos digeridos inadequadamente podem, além de perder algumas de suas substâncias essenciais, ter suas moléculas absorvidas inapropriadamente pela circulação sistêmica. Isto pode desencadear uma série de doenças e alergias alimentares.

  1. Enzimas Digestivas

As enzimas digestivas são proteínas complexas, classificadas em três tipos: enzimas proteolíticas, que digerem proteínas; lípases, que digerem gorduras; e amilases, que, por sua vez, digerem os carboidratos.

Exemplos de enzimas auxiliares na digestão são dados a seguir:

    1. Papaína

Papaína, ou papaiotina, é uma mistura de enzimas proteolíticas obtidas do latex do mamoeiro, Carica papaya Linné, Caricaceae. São utilizados os frutos maduros por causa de sua exsudação ser mais vigorosa que em qualquer outra parte da planta. Deve digerir, no mínimo, 100 vezes o seu peso de albumina de ovo recentemente coagulada, ou 200 a 250 vezes a fibrina de sangue, fresca.

      1. A papaína pode ser obtida de diferentes formas:

  • Papaína do látex

O látex é obtido através de 3 a 4 incisões longitudinais na casca do fruto verde do mamão enquanto ainda está na árvore. O látex é inicialmente líquido, porém rapidamente se transforma em gel e, permanecendo frio, se contrai e libera pequenas quantidades de “soro”. A coagulação é acelerada pelo contato com a água e retardada pela adição de substâncias como: flúor, citrato e oxalato. O látex absorve água e mantém a consistência gelatinosa até uma diluição de 3 vezes o seu volume.

A adição de cloreto de sódio (10% do volume total) precipita a parte sólida do látex em forma compacta, que ainda apresenta atividade enzimática considerável. A partir de 10 gramas de látex misturados com 20 mL de água e 3 gramas de cloreto de sódio, e após serem submetidos à centrifugação, obtém-se cerca de 26 mL, onde está aproximadamente a metade da enzima total. Esse preparado enzimático, extraído do látex, é comumente conhecido como papaína bruta.

  • Enzima do suco prensado do fruto

A tentativa de obtenção da enzima residual do suco prensado não teve sucesso, devido à ação destrutiva da enzima presente no látex. O suco fervido mostrou ser menos destrutivo para a enzima.

Devido a esse comportamento no suco prensado, a enzima poderia ser extraída da polpa do fruto após a adição de sulfeto de hidrogênio, porém experimentos demonstraram que este método não foi satisfatório. O melhor método seria a partir de 100 gramas de polpa de mamão verde (na qual já foi feita a "sangria" para obtenção do látex) que, após ser ralada (e não triturada), é misturada com 100 mL de citrato 0,01N, pH 5,0, para retardar a coagulação do látex. Essa solução de citrato deve ser previamente saturada com sulfeto de hidrogênio. A polpa é prensada em tecido, obtendo-se cerca de 130 mL de extrato. Esse extrato de polpa é completamente misturado com 15 mL de cloreto de sódio a 20% e prensado. O suco prensado é então diluído com igual volume de uma solução saturada de sulfeto de hidrogênio, sendo obtidos 66 mL.

O rendimento total é de 105 mg da enzima a partir de 100 g do fruto, ou seja, 0,1%. A quantidade de enzima obtida do fruto após sua coleta é pequena e não maior do que a obtida na segunda “sangria”. Assim, é melhor não sacrificar o fruto para obter o suco prensado, e sim mantê-lo e realizar várias sangrias.

  • Extração da papaína das folhas

Folhas, talos, pecíolos das flores e cascas produzem sucos prensados contendo a enzima. O suco prensado das raízes não apresenta enzimas. Já o suco prensado de folhas e talos apresenta menos substâncias destrutivas e inibitórias que o látex da fruta.

O experimento deve ser realizado da seguinte forma: 70 g de folha produzem cerca de 25 mL de suco. Após a centrifugação, é obtido um volume de 21,5 ml do suco prensado. A clarificação do suco e inibição dos processos oxidativos que levam à inativação da enzima são realizados pela redução de pH para 4,0 com ácido sulfúrico, clorídrico ou acético. O suco acidificado e filtrado apresenta cerca de 6% de substâncias sólidas. O nitrogênio total corresponde a 0,32% do suco, o que equivale a 2% de proteína. O suco pode ser filtrado em papel, carvão ou sílica, sem perda da atividade enzimática.

  • Semi-purificação da enzima a partir do suco prensado

A enzima pode ser removida do suco acidificado e filtrada após precipitação. Duas formas de precipitação das proteínas são comuns: através de álcool e de sulfato de amônio, que dão bons resultados.

A precipitação com álcool é realizada em temperatura ambiente, pela adição de 5 volumes de etanol 92%. O precipitado contendo enzima desnatura se permanecer na solução alcoólica, portanto, deve ser removido o mais rápido possível, sendo prensado entre 2 folhas de papel de filtro e posteriormente seco a vácuo a 48ºC.

A precipitação com sulfato de amônio é realizada saturando o suco pela adição de 2 volumes de sulfato de amônio e mantendo uma noite sob refrigeração, sendo posteriormente filtrado. Após prensar e secar o precipitado a vácuo, este irá apresentar aproximadamente 50% de sulfato de amônio. A precipitação da enzima não é completa com a concentração de sal utilizada. O precipitado com sulfato de amônio apresenta maior atividade, com rendimento menor.

A fermentação dos açúcares pela adição de leveduras produziu pequena ou nenhuma alteração no conteúdo da enzima, e pode ser um método de purificação.

O álcool e o sulfato de amônio são reagentes que podem ser recuperados através da destilação e cristalização, respectivamente, a partir da solução estoque evaporada. A adição de 2 volumes de álcool à solução estoque sem evaporação prévia precipita quase todo sulfato de amônio. Este, posteriormente, é filtrado, e o álcool é recuperado através da destilação.

  • Cristalização da papaína

A 180 g de látex de mamão seco, misturar 100 g de celite e 150 g de areia lavada em um gral, e triturar totalmente com 200 a 300 ml de solução de cisteína a 0,04M. Essa solução é feita dissolvendo-se 6,3g de cisteína hidroclorada em 1000 ml de solução de NaOH 0,054N. Ela contém excesso de álcali para levar o pH do extrato aquoso para 5,5. A suspensão é deixada decantando para separar o sobrenadante. A extração e trituração são repetidas com outros 300 ml da solução de cisteína, seguindo-se uma decantação, como anteriormente. O gral é lavado com solução de cisteína até que um volume total de 1 litro tenha sido utilizado para extração e lavagem. A suspensão resultante é agitada e filtrada em funil de Büchner grande, com uma sucção suave através de uma camada de 0,5cm de Hyflo Super-Cell sobre papel de filtro Whatman nº 1.

O filtrado (fração 1) é opalescente, amarelo esverdeado e com pH em torno de 5,5. A fração 1 é ajustada a pH 9,0 com aproximadamente 110 ml de solução de NaOH 1N, que é adicionada lentamente, sob agitação. Um precipitado acinzentado fino aparece, sendo removido por centrifugação a 2600 rpm por 1 hora. O sobranadante (fração 2) deve estar claro. O precipitado consiste de proteína desnaturada, que não pode ser redissolvida. A fração 2 é levada a um nível de saturação de 0,4 com sulfato de amônio sólido (250 g por litro). Um precipitado branco aparece e a suspensão é mantida por 1 a 2 horas a 4ºC. O precipitado (fração 3) é então removido por centrifugação a 2500 rpm por 1 hora e o sobrenadante rejeitado (fração 3). Esse precipitado é lavado uma vez com 400 a 500 ml de solução de sulfato de amônio frio (250 g por litro) e separado por centrifugação como citado anteriormente. A fração 3 é redissolvida em 600 ml de cisteína 0,02M (pH 7 – 7,5), sendo adicionados lentamente 60 g de cloreto de sódio.

A papaína é precipitada como um sólido fino e branco por este procedimento. Esta suspensão permanece por 1 hora a 4ºC, sendo centrifugada por 1 hora a 2500 rpm e o sobrenadante resultante é descartado. O material sólido obtido é re-suspenso em 400 ml de cisteína 0,02M a pH 6,5. Um suave aumento de pH geralmente ocorre quando se adiciona a proteína à solução de cisteína, sendo necessário ajustar a suspensão para pH 6,5. A suspensão desenvolve um brilho cristalino em aproximadamente 30 minutos em temperatura ambiente, sendo mantida por uma noite a 4ºC. Os cristais brilhantes (fração 5) são removidos por centrifugação de 2000 a 2500 rpm por 4 a 5 horas. O sobrenadante (fração 5) é descartado.

      1. Características da papaína

Atua em pH ótimo 5 a 7, porém a ação pode estender-se de 3 a 9 e, segundo outros, até 12. O pH ótimo varia de acordo com a natureza do substrato: para a gelatina, peptona e substratos sintéticos simples, o pH é 5; para a fibrina, caseína e hemoglobina, é próximo da neutralidade.

Algumas papaínas comerciais digerem melhor em meio alcalino, outras em meio ácido. A temperatura ótima é de 50º a 70ºC. Acima de 75º ou 80º, a inativação é rápida. A umidade máxima para a conservação do produto é de 5%, sendo em geral entre 3 e 4%.

A partir da papaína, foi isolada a papase, com atividade proteolítica. São citadas três grandes áreas de aplicação de atividade enzimática:

- redução de hematoma, inflamação ou edema;

- aumento do efeito antibiótico em infecção local, pelo aumento da rapidez na digestão das paredes de fibrina que fecha as áreas lesadas, e pelo aumento da permeabilidade celular e tecidual;

- eliminação de perturbações respiratórias pela liquefação das secreções mucosas das vias aéreas.

A papaína, além de ser proteolítica, tem ação de lipase e de lisozima (antibacteriana). Além disso, pode ser utilizada na digestão de proteínas, como clarificante de bebidas alcoólicas.

Antigamente, foi empregada para eliminar falsas membranas e verrugas e no tratamento de peles de animais. É recomendada para o amaciamento de carnes.

As plantas ditas carnívoras ou insetívoras (Nepenthes, Drosera, Darlingtonia), encerram um suco análogo, porém muito menos ativo.

A papaína é empregada em Farmacotécnica sob a forma de pó em cápsulas amiláceas e em elixires e xaropes, ou soluções para aplicação tópica.

    1. Pepsina

É uma substância que contém a enzima proteolítica obtida da mucosa do estômago fresco de porco. Deve digerir no mínimo 3000 e no máximo 3500 vezes seu peso de clara de ovo recentemente coagulada.

      1. Produção de pepsina

A mucosa do estômago de porco deve ser fatiada e misturada em duas ou três vezes seu volume de ácido clorídrico diluído ou ácido fosfórico a pH 2,0, e mantida por 16 horas em temperatura ambiente, em seguida, eleva-se a temperatura até 40 – 45ºC por uma hora. Um procedimento alternativo seria manter por dois dias a 38ºC. Este tratamento ácido modifica o pepsinogênio em pepsina. O tecido não digerido é então filtrado, e o filtrado, seco em secador a vácuo a 40ºC.

A preparação da pepsina de alta potência e pureza é obtida através da concentração a vácuo do filtrado, resfriamento a 5 – 8ºC e adição de etanol para atingir a concentração de 60%. A mucina que precipita é removida. A pepsina é precipitada pela adição de mais etanol, sendo recuperada através de filtração e secagem a baixa temperatura.

      1. Empregos da pepsina

Sendo uma enzima proteolítica secretada pelas glândulas gástricas, tem função nos estágios iniciais da digestão da proteína. É utilizada com eficácia no tratamento dos distúrbios digestivos associados com a diminuição da atividade secretora gástrica. Clinicamente, uma deficiência da pepsina no suco gástrico está ligada à produção inadequada de ácido clorídrico. No tratamento deste estado, resultados semelhantes serão obtidos com a administração de ácido clorídrico em concentração adequada. Aparentemente, a digestão da proteína ocorrerá de modo adequado no intestino. A dose de pepsina é de 0,2 a 2,0 g e deve ser acompanhada de quantidades adequadas de ácido clorídrico.

A pepsina aparece só ou associada a diversas enzimas ou drogas, sob a forma de: cápsulas, elixires, pós, soluções, etc.

Nos elixires de pepsina, ao invés de ácido clorídrico, pode aparecer um ácido orgânico, como o cítrico e o lático (elixires de pepsina simples e composto, respectivamente, do National Formulary IX). Além destas preparações, há ainda o elixir de pepsina e renina e o sacareto de pepsina.

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