Métodos Cromatográficos

Métodos Cromatográficos

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Professora Cláudia Sampaio de Andrade Lima Departamento de Biofísica e Radiobiologia - UFPE

Cromatografia é um processo físico de separação, no qual os componentes a serem separados distribuem-se em duas fases: fase estacionária e fase móvel.

Em sua expressão mais simples, podemos definir a cromatografia como um processo de análise imediata por migração diferencial dos componentes de uma mistura, dentro do sistema cromatográfico.

As origens da Cromatografia estão muito relacionadas com o estudo de produtos naturais e as dificuldades em relação à purificação desses compostos levaram à melhoria na performance dos processos de extração e isolamento.

Para resolver problemas de análise, é indispensável a escolha da técnica cromatográfica mais apropriada, em função da natureza das substâncias a separar.

Uma grande parte dos problemas de separação de compostos orgânicos são resolvidos com o conhecimento dos fenômenos de adsorção e partição, porém a cromatografia, nas suas várias versões, é um método de escolha na separação de biomoléculas. Somente na área de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) encontram-se aplicações na indústria farmacêutica, biotecnologia, investigação biomédica e bioquímica, energia, alimentação, cosméticos, meio ambiente e vitaminas. Com o crescente interesse no descobrimento de novos metabólitos de várias fontes (vegetal, de microrganismos e organismos superiores marinhos e terrestres) existe a necessidade de separação de misturas em pequenas quantidades, de maneira rápida, eficaz e econômica.

Em 1906, um botânico russo, chamado TSWETT, estudava os pigmentos dos vegetais. Ele queria filtrar uma solução de pigmento de folhas verdes em éter de petróleo, com a ajuda de um tubo de vidro cheio com carbonato de cálcio. Ele observou a formação de uma série de bandas horizontais coloridas, amarelas e verdes, correspondentes aos diferentes constituintes da mistura, que se encontravam assim fracionados. Desta forma foi lançada a base da técnica cromatográfica. Vinte e cinco anos passaram-se até que, em 1931, KUHN e LEDERER mostram a importância da técnica de TSWETT, na separação de a e β-carotenos.

Em 1941, MARTIN e SYNGE, estudando a solubilidade de aminoácidos acetilados em diferentes solventes, descobriu a cromatografia de partição, cromatografia líquido-líquido (contra-corrente).

CONDSEN e CORDON foram os precursores da cromatografia de partição sobre papel, utilizando uma coluna de vidro cheia de rodelas de papel de filtro superpostas, para a separação de amino-ácidos não acetilados.

Em 1938, IZMAILOW e SCHRAIBER, descreveram um método onde utilizavase camadas finas de alumina sobre placas de vidro. Onze anos depois, MEINHARD e HALL introduziram a utilização do amido, como ligante do adsorvente (alumina) distribuído sobre as placas de vidro. Mas, foi STAHL, a partir de 1958, que padronizando o método da cromatografia em camada fina, mostrou sua utilidade geral e fez com que ela adquirisse considerável importância na maioria dos laboratórios.

A cromatografia em fase gasosa, utilizada na prática por JAMES e MARTIN em 1952, é uma aplicação da cromatografia de adsorção e da cromatografia de partição. É destinada a separar compostos gasosos. Esta técnica foi idealizada desde o início por MARTIN e SYNGE.

Um dos últimos princípios utilizados foi o da cromatografia por troca iônica. Um trocador de íons é um composto que porta íons relativamente móveis, que podem, em presença de uma solução, serem trocados pelos íons livres da solução. Em 1856, THOMPSON colocou este fenômeno em evidência. Depois, em 1907, GANS preparou trocadores de íons artificiais.

Em 1976, foi introduzido o conceito de cromatografia a média pressão para a separação de diastereoisômeros de oxazolidinas.

Sistema cromatográfico é o conjunto formado pela mistura a ser analisada, pela fase fixa e pela fase móvel. A fase fixa, também chamada fase estacionária, é o meio constituído ou suportado por um sólido poroso, cuja função é reter os solutos. A fase móvel é o solvente, neste caso chamado de eluente, que flui através da fase fixa, e tem como função deslocar os solutos. Neste sistema, a mistura de solutos é levada a migrar através da fase fixa, por meio de fluxo constante da fase móvel, sendo a diferença de velocidade de migração (migração diferencial) provocada por processo de competição pelo soluto, entre as duas fases.

Tipo de cromatografia

Natureza da fase estacionária Natureza dos compostos a separar

Adsorção Sílica gel A maior parte dos compostos orgânicos simples. As moléculas contendo vários grupos polares, as substâncias com caráter eletrofílico e as substâncias com baixo peso molecular, em geral.

Óxido de alumínio As vitaminas solúveis, os alcalóides, os corantes alimentares, os plastificantes, etc. As substâncias com caráter nucleófilo.

Partição Líquido imiscível com a fase móvel (normalmente de alta polaridade)a

Açucares e compostos anfotéros (aminoácidos)

Troca de íons Resinas trocadoras de íons: Ex.: Amberlite, Dowex

Compostos cuja carga elétrica depende do pH (nucleotídeos, ácidos carboxílicos, etc)

Exclusão Gel com propriedades elásticas, que permitem a passagem de substâncias até um determinado tamanho molecular

Grupos de substâncias com similaridade físico-química e pequenas diferenças no tamanho molecular.

Bioafinidade Matriz de ancoragem, ligada a um suporte neutro

Técnica exclusiva de purificação de substâncias que contém especificidade molecular, a exemplo de antígenos, hormônios, vacinas, enzimas, etc.

Adsorção é um fenômeno físico-químico através do qual um sólido (adsorvente) fixa em sua superfície um líquido ou um gás, por meio de interações semelhantes às “forças de Van Der Waals”. Chama-se coeficiente de adsorção à relação k N N onde Na e Nn são respectivamente o número de moles adsorvidos e não adsorvidos de uma determinada substância. Compostos diferentes possuem diferentes valores de ka, estes variando com a temperatura e com a natureza do adsorvente. Se uma mistura de vários componentes é forçada a passar através de um tubo contendo um adsorvente (coluna cromatográfica), cada componente necessitará de um intervalo de tempo diferente para transpor a coluna. Esse intervalo de tempo é denominado tempo de retenção (Tr). A Figura 2.1a ilustra um processo de Cromatografia por Adsorção. A substância mais fortemente adsorvida é mais dificilmente arrastada pela Fase Móvel.

Figura 1: Diferença entre Cromatografia de Adsorção e Cromatografia de Partição

Se uma substância é adicionada a um recipiente contendo dois líquidos não miscíveis, ela se dissolverá parcialmente em cada solvente, de modo a ser constante a relação C1 / C2, onde C1 e C2 são as concentrações da substância em cada um dos dois líquidos. Denomina-se coeficiente de partição à relação k C C

A separação de substâncias contidas em uma amostra através do método da

Cromatografia por partição se dá através dos coeficientes de partição de cada substância.

Coeficiente de partição : é a razão das concentrações de um soluto em presença de dois solventes não miscíveis, em equilíbrio. O conhecimento do coeficiente de partição nos permite estudar o fenômeno que ocorre na cromatografia de coluna.

Terras de diatomácea - A fase estacionária é também constituída por gotículas microscópicas, retidas nas carapaças da diatomita. O fenômeno de adsorção neste caso é bastante reduzido e trata-se de uma partição líquido-líquido típica. O solvente fixo é muito acessível pelo soluto, o que permite separar moléculas bem grandes, tais como as proteínas.

Amido de batata - O amido pode reter até 35% de água e constitui um bom suporte para uma fase estacionária. Entretanto, não possui uma grande capacidade de separação, mas o emprego de colunas grandes, permite a preparação de quantidades relativamente grandes. Os fenômenos de adsorção são de certa forma, intensos, quando as colunas são utilizadas para separar diferentes substâncias (por exemplo, misturas simples de aminoácidos), observa-se que a adsorção é praticamente o único fenômeno envolvido.

Celulose - Nas colunas por partição a celulose é bastante utilizada, sobretudo sob a forma de pós. A celulose é um suporte hidrofílico, porém , existe a possibilidade de preparação de celuloses hidrofóbicas para a cromatografia de fase inversa.

A cromatografia em papel (CP) é uma das técnicas mais simples e que requer menos instrumentos para sua realização, porém é a que apresenta as maiores restrições para sua utilização em termos analíticos.

Este é um método de extensão da cromatografia de partição sobre colunas de celulose, idealizado por CONSDEN, GORDON e MARTIN. Podemos considerar que o papel constitui um suporte inerte, que retém uma fase estacionária aquosa. A partição é efetuada entre a fase aquosa fixa e a fase orgânica móvel

A aparição de novas técnicas utilizando papéis como trocadores de íons, de celuloses hidrofóbicas, de celuloses adsorventes, transformou este método em uma técnica universal de micro-análise.

Na cromatografia de papel, empregam-se quantidades de amostra na ordem de microgramas ou miligramas. A resolução depende da concentração e do diâmetro da mancha aplicada. As substâncias hidrofílicas são separadas com facilidade, enquanto as hidrofóbicas requerem tratamento especial do papel. As fases móveis devem estar saturadas com água. Utilizam-se cubas vedadas e de preferência com saturação do solvente antes do início da separação cromatográfica. O desenvolvimento pode ser ascendente, descendente, circular ou horizontal.

Fase móvel - A fase móvel em cromatografia sobre papel é variável e possui maior efeito nas separações dos componentes de uma mistura. Considerando um par de líquidos, o menos polar funciona como fase móvel e o mais polar, como fase estacionária.

O papel é recortado em forma de um círculo. No centro deste é feito um pequeno orifício. As substâncias são colocadas sobre uma circunferência em torno do centro. O círculo de papel é então colocado em uma cuba circular, o solvente é derramado a partir da parte inferior da cuba e conduzido por capilaridade até a porção central do papel. As substâncias se apresentam ao final da migração como arcos em torno do centro.

Papéis simples - Os primeiros ensaios foram conduzidos sobre papéis de filtro comuns. Porém a sua qualidade era inadequada, levando à necessidade de preparação de papéis especiais, que conduzissem a resultados reproduzíveis, sendo necessário uma certa regularização na sua fabricação e os papéis deviam apresentar um certo grau de pureza. Atualmente, os diferentes papéis se destacam pela sua eficiência, sua durabilidade e pelo seu grau de pureza.

Papéis especiais - São papéis com propriedades adsorventes. Eles foram criados para adaptar as vantagens da cromatografia de papel à cromatografia de adsorção. Para tal, fixa-se sobre o papel (entre as fibras de celulose) uma substância dotada de propriedades adsorventes, principalmente a alumina e a sílica.

Quando está terminada a migração do solvente, é conveniente que o cromatograma seja submetido a um tratamento, de forma a colocar em evidência as substâncias separadas. A revelação não apenas torna visíveis as substâncias incolores, mas também facilita a identificação destas substâncias. Isto é possível pela pulverização de reativos específicos ou de procedimentos físicos convenientes.

Podemos subdividir a CCD em três gupos:

a)Análise qualitativa, que permite determinar o número dos constituintes de uma mistura desconhecida e qual a fase móvel e estacionária, ideais para a separação cromatográfica. b) Análise preparativa, que permite, após separação de pequenas quantidades de substâncias para estudos químicos ou físico-químicos, purificação de pequenas quantidades dos constituintes. c) Análise quantitativa, que consiste em determinar as proporções exatas de cada um dos constituintes da mistura.

Um adsorvente, selecionado de acordo com as características da amostra, é disposto sob a forma de uma camada fina sobre uma placa de vidro. Após ativação pelo calor, seguida do depósito das substâncias a analisar. A placa é colocada em uma cuba fechada contendo o solvente. Terminada a migração, os resultados serão observados utilizando diferentes métodos de revelação. A Figura 2. ilustra o processo.

O líquido ascende (por capilaridade) e arrasta seletivamente os componentes de uma mistura binária (A e B) colocada em 1 (ponto de aplicação). Quando o solvente se aproxima da outra extremidade da placa (2), esta é removida da cuba que contém o solvente e na qual estava parcialmente mergulhada, na posição vertical e a um nível abaixo do ponto de aplicação. As razões de frente, RfA = d1 / d3 e RfB = d2 / d3 são características de cada substância, dependendo da natureza da fase móvel e da fase estacionária. A Cromatografia em Camada Delgada é a mais empregada em Análise qualitativa ou semi-quantitativa. Em virtude da pequena quantidade de amostra utilizada, é menos indicada para fins preparativos. quando é necessário se obter uma quantidade maior das substâncias puras, emprega-se a cromatografia em coluna.

Fig. 2 - Cromatografia em Camada Delgada.

Neste exemplo, a amostra contém dois componentes, A e B, que são identificados pelos respectivos valores de Rf

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